李居寧，易慶平

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北 荊門 448000）

青島啤酒酵母和高濃酵母原生質(zhì)體融合選育高濃釀造菌株

李居寧，易慶平

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北 荊門 448000）

以青島啤酒酵母和高濃酵母為供試菌株，通過原生質(zhì)體融合得到融合子。對(duì)融合子利用銅抗性初篩，利用耐壓和發(fā)酵性能為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室和100 L發(fā)酵復(fù)篩，并對(duì)融合子進(jìn)行鑒定及遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：通過原生質(zhì)體融合選育出的高濃菌株與青島啤酒酵母菌株相比，表現(xiàn)出酵母數(shù)峰值高、降糖和還原雙乙?？斓膬?yōu)勢(shì)，且代謝風(fēng)味物質(zhì)組成與青島啤酒酵母接近；經(jīng)過連續(xù)使用8代后，其總?cè)旧wDNA指紋圖譜保持一致，證明該菌株的遺傳穩(wěn)定性高。

原生質(zhì)體融合；高濃酵母；青島啤酒酵母；選育；高濃釀造

啤酒質(zhì)量的關(guān)鍵是發(fā)酵菌種，酵母是啤酒的靈魂[1]。酵母菌種的優(yōu)化、培育、篩選工作被啤酒生產(chǎn)廠家放在非常重要的位置。選育一株耐高酒精度、耐高糖度、耐高滲透壓、同時(shí)分泌良好風(fēng)味物質(zhì)的酵母菌是高濃釀造啤酒的核心工作。近年來，國內(nèi)外許多釀造工作者在啤酒菌株性能及選育方面進(jìn)行大量研究[2-4]。國外部分研究者利用酵母融合技術(shù)選育釀酒菌種，取得了較理想效果[5]。通過原生質(zhì)體融合得到的菌株具有遺傳親本的許多優(yōu)良性狀，啤酒酵母原生質(zhì)體融合菌株在實(shí)驗(yàn)室的研究較多[6-12]，工業(yè)上的應(yīng)用鮮有報(bào)道[13-14]。在啤酒釀造中菌種代謝產(chǎn)生的酶催化一系列生化反應(yīng)產(chǎn)生的雙乙酰、乙醛和高級(jí)醇等物質(zhì)會(huì)影響啤酒口感及質(zhì)量。本研究以選育優(yōu)良的啤酒高濃釀造生產(chǎn)菌株為目的，通過青島啤酒酵母和高濃酵母為親株進(jìn)行原生質(zhì)體融合，對(duì)融合子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室復(fù)篩和100 L發(fā)酵復(fù)篩，獲得既能適應(yīng)高濃釀造、高酒精環(huán)境，又能保持青島啤酒基本風(fēng)味的融合菌株，對(duì)滿足工業(yè)生產(chǎn)所要求的高濃釀造、提高啤酒產(chǎn)量具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

根據(jù)青島啤酒公司酵母菌種庫的檔案數(shù)據(jù)，從中挑選S.cerevisiae屬中的優(yōu)質(zhì)的青島啤酒酵母和高濃酵母作為融合親株通過初篩和100 L發(fā)酵分析篩選得到4株供試菌：青島啤酒酵母T1（T2318）、青島啤酒酵母T3（T2360）、高濃酵母H4（1300）、高濃酵母H6（1325）。

11°P麥芽汁培養(yǎng)基加蛋清澄清處理后，115℃、20 min濕熱滅菌后使用。銅抗性篩選培養(yǎng)基：YEPD固體培養(yǎng)基融化后冷卻至55～60℃，無菌操作加入一定量滅菌的1 mol/L CuSO4，使培養(yǎng)基中CuSO4的濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

1.1.2 試劑[15]

限制性內(nèi)切酶Bcl I、EcoRI、Eco RV、Dra I，0.1 mol/L Tris[15]飽和酚、氯仿(分析純) 南京市華美日化工有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

90-B型PCR儀 中國科學(xué)院遺傳研究所；生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CHEF-DR Ⅲ脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；DYY-5穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京六一儀器廠；1100型高效液相色譜分析儀 美國安捷倫公司；1 000 L糖化設(shè)備 德國Jacalb Karl公司；100 L啤酒發(fā)酵設(shè)備 哈爾濱漢德釀造設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 糖化工藝

糖化工藝的設(shè)計(jì)原則為在遵循青島啤酒的生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上提高原麥汁濃度到150°P，具體配方及工藝如表1所示。

表1 糖化配方Table 1 Formulation of raw materials used in saccharification

糖化工藝曲線如圖1所示。

圖1 糖化工藝曲線Fig.1 The curve of saccharification process

1.2.2 酵母擴(kuò)培[16]

試管斜面5 mL液體麥汁培養(yǎng)基試管（25℃培養(yǎng)24 h）10 mL液體麥汁培養(yǎng)基試管（25℃培養(yǎng)36 h）240 mL液體麥汁培養(yǎng)基三角瓶（20℃培養(yǎng)36 h）2 000 mL液體麥汁培養(yǎng)基三角瓶（18℃培養(yǎng)36 h）2瓶2 000 mL培養(yǎng)液進(jìn)100 L發(fā)酵罐。

1.2.3 發(fā)酵工藝

麥汁溫度（8.0±0.5）℃進(jìn)罐，滿罐后24 h內(nèi)排渣1次；自然升溫至9.0～9.5℃發(fā)酵；當(dāng)糖度降至4.8～5.2oBx，升溫至12 ℃，還原雙乙酰；當(dāng)糖度降至3.8～4.2oBx，封罐，保持罐壓0.8～1.0 kg/cm2；封罐24～48 h回收酵母，以后每2 d排1次酵母；雙乙酰降至0.05 mg/L時(shí)降溫，溫度降至0 ℃后貯7 d。

1.2.4 原生質(zhì)體制備及再生[17-18]

制備：取處于對(duì)數(shù)生長中期的酵母菌液5 mL，3 500 r/min、5 min離心收集菌體，菌體經(jīng)PB離心機(jī)離心洗滌2次，懸浮于2 mL 0.3%β-巰基乙醇-0.1%EDTA-Na2中，于37℃水浴保溫10～15 min，3 500 r/min離心5 min收集菌體，0.18 mol/L KCl溶液洗滌2次，懸浮于1 mL 2%的蝸牛酶液中，37℃恒溫水浴酶解。酶解結(jié)束后，4 000 r/min離心10 min去除蝸牛酶液，pH 6.12高滲緩沖溶液洗滌2次，收集原生質(zhì)體。

再生：雙層平板法，首先在培養(yǎng)皿中鋪一底層含瓊脂2.5%的高滲YEPD再生培養(yǎng)基，放溫箱中烘數(shù)小時(shí)，使其表面脫水。然后將10 mL預(yù)先保溫在40℃、含有0.5%瓊脂并混合了l mL原生質(zhì)體懸液的YEPD高滲再生培養(yǎng)基倒入至底層平板中制成雙層平板，30℃培養(yǎng)48 h。

原生質(zhì)體融合方案：T1＋H4；T1＋H6；T3＋H4；T3＋H6。

1.2.5 融合子銅離子抗性初篩

將培養(yǎng)出的菌落挑至無菌水中，饑餓，用饑餓后的菌懸液點(diǎn)板，分別將融合子及其親株點(diǎn)至含Cu2+濃度為4、6、8、10 mmol/L的YEPD固體培養(yǎng)基平皿上，點(diǎn)板后倒置培養(yǎng)，比較不同的Cu2+梯度平板上菌落的生長情況。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)室水平復(fù)篩

將初篩獲得的菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，每株1瓶，以耐酒精度、耐壓指標(biāo)、抗自溶能力、發(fā)酵力為指標(biāo)進(jìn)行篩選，分別篩選出耐酒精度≥9%的融合子、蛋白酶活力≤0.25U/mg、起發(fā)快、還原雙乙?？?、CO2減重多的融合子。

1.2.7 100 L發(fā)酵復(fù)篩

糖化生產(chǎn)15oP麥汁，將1.2.7節(jié)篩選出來的融合子與青島啤酒酵母菌株接入100 L發(fā)酵罐發(fā)酵，連續(xù)15 d，每天稀釋菌液在YEPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后測(cè)定酵母菌數(shù)量、雙乙酰質(zhì)量濃度[19]，發(fā)酵完成后測(cè)定發(fā)酵度[20]、菲林試劑測(cè)糖度[21]、pH值、酵母凝聚性[19]、α-N同化率[21]、可發(fā)酵性殘?zhí)荹22]和風(fēng)味物質(zhì)[23]分析。

1.2.8 限制性片段長度多態(tài)性（restriction fregrmeat length polymorphisms，RFLP）實(shí)驗(yàn)

分別用4種酶包括Bcl I、EcoRI、Eco RV、Dra I對(duì)不同的酵母菌株總DNA進(jìn)行酶切分析。供試酵母菌株的總DNA提取方法參照文獻(xiàn)[24]。Bcl I酶切體系(5 μL)：0.5 μL Buffer E＋0.5 μL BSA＋0.2 μL Bcl I＋2 μL DNA＋1.8 μL dH2O，37 ℃條件下處理10～16 h；EcoRI酶切體系(5 μL)：0.5 μL Buffer H＋0.5 μL BSA＋0.2 μL EcoRI＋2 μL DNA＋1.8 μL dH2O，37 ℃條件下處理10～16 h；Eco RV酶切體系(5 μL)：0.5 μL BufferH＋0.5 μL BSA＋0.2 μL Eco RV＋2 μL DNA＋1.8 μL dH2O，37 ℃條件下處理10～16 h；37 ℃條件下處理10～16 h；Dra I酶切體系(5 μL)：0.5 μL Buffer T＋0.5 μL BSA＋0.2 μL Dra I＋2 μL DNA＋1.8 μL dH2O，37 ℃條件下處理10～16 h。

1.2.9 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在生產(chǎn)廠連續(xù)使用8代篩選獲得的融合子，回收后貯存于－80℃，同時(shí)采用CHEF電泳技術(shù)[25]對(duì)高濃酵母菌株的總?cè)旧w結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合子的篩選

酵母原生質(zhì)體融合獲得的融合子，其重組率相對(duì)較高，根據(jù)前期確定的銅抗性篩選標(biāo)記，首先對(duì)融合子進(jìn)行初步篩選，挑選出200支融合子。雖然原生質(zhì)體融合具有定向育種的含義，但是融合子的性能不同的情況依然存在，只是性狀變化的范圍有所限制，所以要根據(jù)需要，對(duì)融合子作進(jìn)一步的定向篩選。

2.1.1 銅抗性標(biāo)記初篩

圖2 融合子菌株銅抗性篩選Fig.2 Copper resistance of the parental strains and their fusants

將培養(yǎng)出的菌落挑至無菌水中，饑餓，用饑餓后的菌懸液點(diǎn)板，分別將融合子及其親株點(diǎn)至含Cu2+濃度為4、6、8、10 mmol/L的YEPD固體培養(yǎng)基平皿上，點(diǎn)板后倒置培養(yǎng)，觀察結(jié)果如圖2所示。每個(gè)平皿中最上方5個(gè)菌落為融合親株，后面的20個(gè)菌落為融合子。結(jié)果說明在4 mmol/L CuSO4的YEPD培養(yǎng)基中融合親株還能生長，而在高于4 mmol/L CuSO4的YEPD培養(yǎng)基中融合親株不能生長，而融合子生長良好。比較不同的Cu2+梯度平板上菌落的生長情況，將在較高Cu2+濃度平板上長出的融合子200支接斜面，4 ℃保存。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)室水平復(fù)篩

利用耐壓指標(biāo)和發(fā)酵性能作為篩選標(biāo)記，逐步篩選優(yōu)良高濃酵母，通過耐酒精度為指標(biāo)篩選81支耐酒精度≥9%的融合子；以抗自溶能力為指標(biāo)篩選出蛋白酶活性≤0.25 U/mg的融合子43支；以發(fā)酵力為指標(biāo)，選擇啟發(fā)快、雙乙酰還原快、CO2減重多的融合子共2支（融合子1、融合子2）。

2.2 100 L發(fā)酵復(fù)篩

2.2.1 酵母數(shù)變化

啤酒發(fā)酵是依賴于啤酒酵母,對(duì)麥汁某些組分進(jìn)行一系列的代謝過程,產(chǎn)生酒精等各種風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成獨(dú)特風(fēng)味的飲料,整個(gè)發(fā)酵籠統(tǒng)地可分3個(gè)階段：酵母恢復(fù)階段，有氧呼吸階段，無氧發(fā)酵階段。融合子2在酵母接種后,開始在麥汁充氧的條件下,恢復(fù)其生理活性；然后以麥汁中的氨基酸為主要氮源和以可發(fā)酵性糖為主要碳源,進(jìn)行呼吸作用,并從中獲得能量而生長繁殖，在5 d內(nèi)就達(dá)到酵母數(shù)最大值[26]；之后即進(jìn)入無氧發(fā)酵階段。而青島啤酒酵母和融合子1分別在12 d和10 d才達(dá)到酵母數(shù)最大值，無氧發(fā)酵階段很短。融合子2酵母峰值明顯高于其他菌株。

圖3 融合子100 L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)酵母數(shù)變化Fig.3 The growth curves of the original strain T1 and two fusants during cultivation in a 100 L fermenter

2.2.2 糖度變化

圖4 融合子復(fù)篩100 L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)糖度變化Fig.4 Time-dependent changes in wort concentration during cultivation of the original strain T1 and two fusants in a 100 L fermenter

融合子發(fā)酵過程中糖度變化見圖4所示。融合子1和融合子2發(fā)酵液的糖度降低比青島啤酒酵母T1多，說明融合子1和融合子2利用的可發(fā)酵糖比青島啤酒酵母T1多，融合子1、融合子2降糖能力明顯強(qiáng)于普通青島啤酒菌株。

2.2.3 雙乙酰變化

如圖5所示，融合子2發(fā)酵液中雙乙酰的質(zhì)量濃度在發(fā)酵過程的12 d就達(dá)到要求≤0.1 mg/L，而融合子1發(fā)酵液中雙乙酰的質(zhì)量濃度在發(fā)酵過程的14 d達(dá)到要求，青島啤酒酵母發(fā)酵液中雙乙酰的質(zhì)量濃度在發(fā)酵過程的15 d還沒有達(dá)到要求，仍在0.3 mg/L。融合子2、融合子1雙乙酰峰值低于普通青島啤酒酵母菌株，而還原速度明顯快于普通青島啤酒菌株，特別是融合子2表現(xiàn)更為突出。

圖5 融合子復(fù)篩100 L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)雙乙酰變化跟蹤Fig.5 Time-dependent changes in diacetyl concentration during cultivation of the original strain T1 and two fusants in a 100 L fermenter

2.2.4 發(fā)酵液其他指標(biāo)

表2 融合子菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)酵液分析Table 2 Analysis of the fermentation broths of the original strain T1 and two fusants

由表2可知，各種指標(biāo)中，3種菌株均達(dá)到啤酒要求，而融合子2的pH值、發(fā)酵度、α-N同化率3種指標(biāo)要優(yōu)于其他兩種菌株，其凝聚性高于青島啤酒酵母T1，低于融合子1。不同啤酒酵母菌株凝集性差異很大。強(qiáng)凝集性酵母，從發(fā)酵液中分離早、沉淀快，因而酒液中酵母數(shù)量少、發(fā)酵慢、發(fā)酵度低；弱凝集性酵母，與發(fā)酵液分離晚，酒液中酵母細(xì)胞密度大、發(fā)酵快、發(fā)酵度高、回收酵母量少，濾酒困難。因此在選擇菌種時(shí)，要求酵母的凝聚性適中，既能達(dá)到較高的發(fā)酵度，又沉淀結(jié)實(shí)、容易分離的菌株。綜合以上因素，融合子2的pH值、發(fā)酵度、α-N同化率、凝集性4種指標(biāo)要優(yōu)于其他兩種菌。

2.2.5 可發(fā)酵性殘?zhí)欠治?/p>

由表3可知，3種菌株對(duì)果糖、葡萄糖和蔗糖的利用率都很高，在發(fā)酵液中都沒有檢測(cè)到3種糖，青島啤酒酵母對(duì)麥芽糖的利用率好于融合子，而融合子2對(duì)麥芽三糖的利用率好于其他2種酵母菌株。

表3 融合子菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)酵液可發(fā)酵性糖殘留分析Table 3 Analysis of fermentable sugar residues in the fermentation broths of the original strain T1 and two fusants

2.2.6 風(fēng)味物質(zhì)組成

表4 發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)分析Table 4 Flavor components of the fermentation broths of the original strain T1 and two fusants

由表4可知，3種菌株的風(fēng)味物質(zhì)組成沒有明顯區(qū)別。綜合以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，融合子1和融合子2（都是T1+H6的融合方式）與青島啤酒酵母T1相比，都表現(xiàn)出酵母數(shù)峰值高、降糖和還原雙乙?？斓膬?yōu)勢(shì)，且代謝風(fēng)味物質(zhì)組成與青島啤酒酵母T1非常接近。其中融合子2的優(yōu)勢(shì)更突出，最終選擇融合子2作為青島啤酒高濃酵母。

2.3 融合子的鑒定

圖6 青島啤酒酵母與融合子2染色體DNA指紋圖譜比較Fig.6 Comparison of chromosomal DNA fingerprint between Tsingtao brewer’s yeast and fusant 2

銅抗性的初篩和耐壓指標(biāo)、發(fā)酵性能的復(fù)篩，也可以看作是對(duì)融合子的鑒定，但只限于外觀表型的鑒定，還需要從酵母細(xì)胞的染色體DNA水平對(duì)融合子進(jìn)行了遺傳本質(zhì)的鑒定。利用RFLP技術(shù)分別對(duì)青島啤酒酵母T1和融合子2做染色體DNA指紋圖譜鑒定，電泳條帶如圖6所示。利用Eco RI 和Eco RV酶切的DNA指紋圖譜顯示融合子2與青島啤酒酵母T1的16S rDNA的序列存在差異，融合子2的DNA-DNA雜交的同源性在90%以上，說明兩株酵母的DNA存在不同，但親緣關(guān)系很近。

2.4 高濃釀造酵母的遺傳穩(wěn)定性

由于原生質(zhì)體的融合會(huì)產(chǎn)生兩種情況,一種是真正的融合，即產(chǎn)生雜合雙倍體，或單倍重組體；另一種是暫時(shí)的融合，形成異核體。前者一般是較穩(wěn)定的，而后者則是不穩(wěn)定的，會(huì)分離成親本類型，有的甚至可以異核狀態(tài)移接幾代[27]。在生產(chǎn)廠連續(xù)使用8代高濃酵母融合子2，回收后貯存于冰箱中，同時(shí)采用CHEF電泳技術(shù)對(duì)高濃酵母菌株的總?cè)旧w結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，總?cè)旧wDNA指紋圖譜如圖7所示。高濃酵母經(jīng)過連續(xù)使用8代后，其總?cè)旧wDNA指紋圖譜基本保持一致，證明該菌株的遺傳穩(wěn)定性較高。

圖7 高濃酵母融合子2連續(xù)使用8代指紋圖譜Fig.7 The fingerprints of funsant 2 during 8 successive passages

3 結(jié) 論

應(yīng)用酵母融合技術(shù)選育既適應(yīng)高濃、高酒精環(huán)境，又能保持青島啤酒基本風(fēng)味的菌株對(duì)滿足高濃釀造、提高啤酒產(chǎn)量意義重大。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，培育出的高濃菌種雜合子與青島啤酒酵母菌株相比，都表現(xiàn)出酵母數(shù)峰值高、降糖和還原雙乙?？斓膬?yōu)勢(shì)，且代謝風(fēng)味物質(zhì)組成與青島啤酒酵母非常接近，達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。雜合子2經(jīng)過連續(xù)使用8代后，其總?cè)旧wDNA指紋圖譜保持基本一致，證明該菌株的遺傳穩(wěn)定性高。

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Strain Improvement through Protoplast Fusion between Tsingdao Brewer’s Yeast and High-Gravity Yeast

LI Ju-ning, YI Qing-ping
(College of Biological Engineering, Jingchu University of Technology, Jingmen 448000, China)

In this study, protoplast fusants between Tsingdao brewer’s yeast and high-gravity yeast were developed and preliminarily screened for their copper resistance. On the basis of this investigation, secondary screening was carried out on a laboratory scale or in a 100 L fermentor with respect to pressure tolerance and fermentation performance. The results showed that the selected fusant strain was superior to Tsingdao brewer’s yeast, as manifested by higher alcohol peaks as well as faster sugar consumption and diacetyl reduction. Moreover, both yeast strains presented similar fl avor compounds profi le during metabolism. The total chromosomal DNA fi ngerprinting of the fusant strain after 8 successive passages remained consistent, suggesting high genetic stability.

protoplast fusion; high-gravity yeast; Tsingdao brewer’s yeast; breeding; high-gravity brewing

TS261.1

A

1002-6630（2014）03-0173-05

10.7506/spkx1002-6630-201403035

2013-02-01

李居寧（1969—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)酵、檢測(cè)。E-mail：lijuning613@163.com