王發(fā)祥，俞 健，王建輝，李向紅，何紀(jì)華，劉永樂(lè)

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410 114）

1株產(chǎn)酸性α-淀粉酶黑曲霉原生質(zhì)體制備和再生條件優(yōu)化

王發(fā)祥，俞 健，王建輝，李向紅，何紀(jì)華，劉永樂(lè)*

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410 114）

通過(guò)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化獲得產(chǎn)酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生質(zhì)體制備和再生的最佳工藝參數(shù)：黑曲霉種齡72 h、孢子濃度7.5×106CFU/mL、滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇濃度0.85 mol/L，以10 g/L蝸牛酶+10 g/L纖維素酶+10 g/L溶菌酶為破壁酶、pH 6.8、酶解溫度37℃、酶解2 h。在此條件下，原生質(zhì)體制備率可達(dá)86.92%，再生率可達(dá)42.67%。

原生質(zhì)體；酸性α-淀粉酶；黑曲霉；響應(yīng)面法；制備；再生

耐酸性α-淀粉酶是在低酸性條件下能水解淀粉的α-淀粉酶。當(dāng)前常用的中溫和高溫α-淀粉酶多為中性α-淀粉酶（最適pH 6.0～7.0），在酸性條件下其酶活性明顯降低，不能滿足酸性條件下淀粉原料深加工工藝的要求[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)外很多研究團(tuán)隊(duì)已對(duì)耐酸性α-淀粉酶進(jìn)行了大量研究，獲得了一些產(chǎn)酸性α-淀粉酶的芽孢桿菌和曲霉，并進(jìn)行了一些菌種選育和基因工程改造的研究[3-7]，但目前仍無(wú)法滿足其產(chǎn)業(yè)化要求；很多國(guó)家也已有耐酸性α-淀粉酶的發(fā)酵產(chǎn)品，但其價(jià)格昂貴難以滿足市場(chǎng)的需要。因此，開(kāi)發(fā)酸性α-淀粉酶具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

微生物原生質(zhì)體誘變技術(shù)是工業(yè)微生物育種的主要技術(shù)，相比常規(guī)誘變育種技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、誘變效果好等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。目前，原生質(zhì)體誘變菌種選育的相關(guān)研究很多，并在產(chǎn)糖化酶、菊粉酶、β-葡萄糖甘酶、單寧酶、植酸酶等菌株選育中獲得了一定成功[10-12]，但以該技術(shù)選育高產(chǎn)酸性α-淀粉酶黑曲霉菌株的研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)和響應(yīng)面法，優(yōu)化1株產(chǎn)酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生質(zhì)體制備和再生的條件，為曲霉孢子原生質(zhì)體制備提供了參考，也為其后續(xù)的原生質(zhì)體誘變育種提供方便。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

黑曲霉JC06，為本實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏。

蝸牛酶、纖維素酶 上海索萊寶生物科技有限公司；溶菌酶 上海博奧生物科技有限公司；β-巰基乙醇、D-甘露醇、D-山梨醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

低滲培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉10、蛋白胨10、酵母膏5、MgSO40.5、MnSO40.3、FeSO40.3、pH 4.5；高滲（再生）培養(yǎng)基：低滲培養(yǎng)基中加入終濃度為0.8 mol/L的甘露醇。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體制備和再生

黑曲霉JC06接種于PDA斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)一定時(shí)間，無(wú)菌水洗脫孢子，參考文獻(xiàn)[9]方法制備孢子原生質(zhì)體和再生。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

按上述方法制備孢子原生質(zhì)體和再生，計(jì)算制備率和再生率。分別考察不同種齡（36、48、60、72、84、96 h）、孢子濃度（5×104、1×105、4×105、8×105、1.6×106CFU/mL）、滲透壓穩(wěn)定劑（蔗糖、NaCl、KCl、甘露醇、山梨醇、MgSO4，均為0.8 mol/L）、復(fù)合破壁酶配比及酶質(zhì)量濃度（20 g/L蝸牛酶+10 g/L纖維素酶、20 g/L蝸牛酶+10 g/L溶菌酶、10 g/L蝸牛酶+20 g/L纖維素酶、10 g/L蝸牛酶+10 g/L纖維素酶+10 g/L溶菌酶、20 g/L蝸牛酶+5 g/L纖維素酶+ 5 g/L溶菌酶）、酶解時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、酶解溫度（27、32、37、42℃）等條件對(duì)其制備率和再生率的影響。

1.2.3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以Minitab 16軟件按表1設(shè)計(jì)PB試驗(yàn)[13]，以原生質(zhì)體制備率和再生率的乘積為響應(yīng)值，確定對(duì)響應(yīng)值影響顯著的重要因素。

表1 PB試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels for PB experimental design

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素和PB試驗(yàn)結(jié)果，以原生質(zhì)體制備率和再生率的乘積為響應(yīng)值，利用Design-Expert 7.1.3軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)[14-15]，共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中3個(gè)為中心點(diǎn)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差，因素水平如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及編碼Table 2 Coded and actual values for variables used in Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果（部分結(jié)果略）表明，種齡、孢子濃度、滲透壓穩(wěn)定劑、復(fù)合破壁酶配比及酶質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)黑曲霉孢子原生質(zhì)體的制備和再生均有一定影響，而且對(duì)制備率和再生率的影響程度不一致。因此，本實(shí)驗(yàn)以制備率和再生率作為主要考察指標(biāo)，篩選到的各因素最佳水平為種齡72h，孢子濃度為7.5×106CFU/mL，甘露醇為酶解液和再生培養(yǎng)基的滲透壓穩(wěn)定劑（圖1），以10 g/L蝸牛酶+10 g/L纖維素酶+10 g/L溶菌酶為破壁酶（圖2），酶解溫度為37℃，酶解時(shí)間為2 h。

圖1 不同滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體形成和再生率的影響Fig.1 Effect of different osmotic stabilizers on protoplast formation and regeneration

圖2 不同酶組合對(duì)原生質(zhì)體形成和再生率的影響Fig.2 Effect of different enzyme combinations on protoplast formation and regeneration

2.2 PB試驗(yàn)結(jié)果

PB設(shè)計(jì)是一種兩水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，能以最少的試驗(yàn)次數(shù)在眾多變量中篩選出對(duì)響應(yīng)值影響的最重要變量[13,16]。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)和孢子原生質(zhì)體制備率和再生率乘積見(jiàn)表3。

方差分析（略）表明主效應(yīng)在95%水平顯著（P=0.016＜0.05），其中因素種齡（A）、甘露醇濃度（C）的P值分別為0.010、0.002，在95%水平對(duì)結(jié)果影響顯著，孢子濃度（P=0.058）、酶解時(shí)間（P=0.130）等其余因素不顯著（P＞0.05）。另外，甘露醇濃度、種齡、pH值和溫度為正效應(yīng)，表明高水平相對(duì)較好；酶解時(shí)間、孢子濃度和酶質(zhì)量濃度為負(fù)效應(yīng)，表明低水平相對(duì)較好。各因素標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖如圖3所示，各因素對(duì)響應(yīng)值影響的重要性依次為：甘露醇濃度＞種齡＞孢子濃度＞酶解時(shí)間＞pH值＞復(fù)合破壁酶配比及酶質(zhì)量濃度＞酶解溫度，其中甘露醇濃度、種齡、孢子濃度在α=0.1水平對(duì)響應(yīng)值影響顯著，可作為決定黑曲霉孢子原生質(zhì)體制備率和再生率的重要因素。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experimental design and results

圖3 各因素標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Parettoo圖（α==00..1100）Fig.3 Pareto chart for standardized effect of each factor (α=0.10)

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)PB試驗(yàn)確定的重要因素以及單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步以響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉孢子原生質(zhì)體制備和再生的條件，以制備率和再生率的乘積（Y）為響應(yīng)值，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

對(duì)表4試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，獲得回歸模型方程為：Y =36.94+1.54X1+0.69X2+3.66X3－3.03X1X2－1.45X1X3－2.11X2X3－9.10X12－5.05X22－7.31X32，方差分析（表5）顯示該模型顯著（P=0.000 7＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.053 9＞0.05），R2為0.982 9，說(shuō)明回歸方程能較好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)回歸方程作出等高線圖及響應(yīng)面圖，由圖3可以直觀看出各因素及其交互作用的變化趨勢(shì)對(duì)制備率和再生率乘積的影響，且回歸模型存在最大值。每個(gè)響應(yīng)曲面均有明顯的峰，說(shuō)明甘露醇濃度、種齡及孢子濃度3個(gè)因素的最佳取值較好地落在設(shè)計(jì)范圍內(nèi)[17]，結(jié)合等高線圖，其最佳取值分別位于0.8～0.9 mol/L、69～78 h、7.0×106～8.0×106CFU/mL范圍；而且甘露醇濃度和孢子濃度對(duì)應(yīng)的曲面比較陡峭，說(shuō)明這兩個(gè)因素相對(duì)于種齡對(duì)結(jié)果影響更加顯著[18-19]，這與方差分析的結(jié)果（表5）一致。

表5 方差分析Table 5 ANOVA for the response surface quadratic regression model

圖4 3種重要因素對(duì)原生質(zhì)體制備和再生率的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots showing the effects of three experimental conditions on protoplast formation and regeneration

為了進(jìn)一步確定變量的最佳取值點(diǎn)，通過(guò)模型方程求導(dǎo)[15,20]，得到原生質(zhì)體制備率和再生率乘積有最大響應(yīng)值時(shí)3個(gè)因素的取值，即孢子濃度7.66×106CFU/mL、種齡71.97 h、甘露醇濃度0.85 mol/L。該條件下預(yù)測(cè)得原生質(zhì)體制備率和再生率乘積為37.44%?？紤]到實(shí)際操作的便利，將最優(yōu)條件修正為孢子濃度7.5×106CFU/mL、種齡72 h、甘露醇濃度0.85 mol/L，在該優(yōu)化條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得實(shí)際原生質(zhì)體制備率為（86.92±2.25）%，再生率為（42.67±1.30）%，二者乘積為37.09%，略低于預(yù)測(cè)值，說(shuō)明用該回歸方程分析所得優(yōu)化提取條件是可信的。

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)、PB試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生質(zhì)體制備和再生的條件，獲得的最佳工藝參數(shù)為：黑曲霉種齡72 h、孢子濃度7.5×106CFU/mL、滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇濃度0.85 mol/L，以10 g/L蝸牛酶+10 g/L纖維素酶+10 g/L溶菌酶為破壁酶、pH 6.8、酶解溫度37℃、酶解時(shí)間2 h。在此條件下，原生質(zhì)體制備率可達(dá)86.92%，再生率可達(dá)42.67%，較以前類似報(bào)道[8-9]有一定提高。本研究為后續(xù)的酸性α-淀粉酶高產(chǎn)黑曲霉菌株的原生質(zhì)體誘變選育工作提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Optimization of Protoplast Formation and Regeneration from an Aspergilli niger Strain Producing Acid-Stable α-Amylase

WANG Fa-xiang, YU Jian, WANG Jian-hui, LI Xiang-hong, HE Ji-hua, LIU Yong-le*
(College of Chemistry and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

The optimum conditions for formation and regeneration of protoplasts from Asperigillus niger with a high yield of acidstable α-amylase we re obtained using one-factor-at-a-time experiments, Plackett-Burman design and response surface methodology as follows: seed age of 72 h, spore concentration of 7.5 × 106CFU/mL, stabilization of the osmotic pressure using 0.85 mol/L mannitol, and hydrolysis of cell walls with a mixture of snailase (10 g/L), cellulose (10 g/L) and lysozyme (10 g/L) at 37 ℃, pH 6.8 for 2 h. Under these conditions, the rates of protoplast formation and regeneration reached 86.92% and 42.67%, respectively.

protoplast; acid-stable α-amylase; Aspergilli niger; response surface methodology; formation; regeneration

Q93.3

A

1002-6630(2014)01-0155-04

10.7506/spkx1002-6630-201401030

2012-12-25

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD31B08）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201427；31101214）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（12JJ6028）；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012NK3061）；長(zhǎng)沙市科技局重點(diǎn)項(xiàng)目（K1201140-21）

王發(fā)祥（1978—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)及農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：wfaxiang@163.com

*通信作者：劉永樂(lè)（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榇笞谵r(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：lyle19@163.com