余春磊，袁金娥，張鹍飛，羅小嬌，齊國昌，馮宗云*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物遺傳育種學(xué)系大麥研究中心，四川 溫江 611130）

回歸正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波提取大麥中4種主要黃酮物質(zhì)工藝

余春磊，袁金娥，張鹍飛，羅小嬌，齊國昌，馮宗云*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物遺傳育種學(xué)系大麥研究中心，四川 溫江 611130）

通過一次回歸正交試驗(yàn)，優(yōu)選出大麥中4種主要黃酮類物質(zhì)的最佳超聲提取工藝。以兒茶素、楊梅素、槲皮 素和山奈酚的含量作為考察指標(biāo)，以甲醇的體積分?jǐn)?shù)、料液比和超聲時(shí)間為試驗(yàn)因素，采用本課題組自行優(yōu)化后的高效液相色譜檢測體系對大麥中4種黃酮類物質(zhì)的含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明：兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚在0.005～0.1 μg都呈良好的線性關(guān)系，測定方法穩(wěn)定，可靠。優(yōu)選超聲提取的最佳提取條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶20（g/mL）和超聲時(shí)間60 min。

大麥；高效液相色譜法；兒茶素；楊梅素；槲皮素；山奈酚

黃酮類物質(zhì)是植物第1大次生代謝產(chǎn)物，在植物的生長發(fā)育過程中起著重要作用，同時(shí)還具有清除自由基、抗衰老、防治心血管疾病等多種藥物學(xué)功能[1]。大麥（Hordeum vulgare L.）是世界上第4大糧食作物，也是一種藥食兼用的植物[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)大麥中黃酮類物質(zhì)含量豐富，具有花奎素、原飛燕草素B-3、花翠素等在其他禾本科中未含有的黃酮類物質(zhì)[5]，但主要以兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚的形式存在[6]。有研究[7]表明這4種物質(zhì)的總量占總黃酮的50%左右。

提取植物黃酮類物質(zhì)的方法較多，如溶劑提取[8-10]、微波提取[11]、超聲波提取法[12-13]、酶解法[14]、超臨界流體萃取[15]、雙水相萃取分離法[16]等。超聲波提取法因操作簡單，所提物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不易被破壞[17-19]等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛用于植物次生代謝產(chǎn)物的提取測定[12-13]。目前大麥黃酮提取研究[20-21]較多，主要集中于總黃酮，王仙等[13]采用響應(yīng)面分析法對超聲輔助提取大麥籽?？傸S酮進(jìn)行了優(yōu)化，總黃酮提取率可達(dá)0.8 mg/g。但對大麥中主要黃酮類物質(zhì)的提取與檢測研究較少，僅楊濤等[6]和賀丹霞等[22]有少量報(bào)道，但這些研究都沒有對4種主要黃酮類物質(zhì)的提取方法進(jìn)行優(yōu)化且采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)行檢測時(shí)4種主要物質(zhì)的得率較低、雜質(zhì)峰較多、分離效果較差，因此本實(shí)驗(yàn)對4種黃酮類物質(zhì)的超聲提取進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得4種黃酮類物質(zhì)超聲提取的最佳工藝，從而為大麥黃酮的深加工利用和富含高含量黃酮大麥的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試大麥品種為94-19-1，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)大麥研究中心提供。

兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈、冰乙酸為色譜純 美國Fisher公司；實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。

1.2 儀器與設(shè)備

1200型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；AS20500B型超聲波清洗機(jī) 廈門力天偉業(yè)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大麥中4種黃酮類物質(zhì)的提取方法

稱取大麥籽粒適量，80 ℃烘干24 h，粉碎過60目篩，分別稱取500 mg樣品于不同的10 mL離心管，按不同料液比向每管加入一定體積的甲醇溶液，在超聲清洗機(jī)中處理一定時(shí)間，提取液5 000 r/min離心8 min，將濾液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶定容至刻度，搖勻，然后用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，取濾液作為供試溶液。

1.3.2 4種黃酮類物質(zhì)的檢測條件

在楊濤等[6]色譜條件的基礎(chǔ)上，本課題組進(jìn)行檢測優(yōu)化，優(yōu)化后的色譜條件為色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：1%冰醋酸（A），乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～10 min，15%～30% B；10～16 min，30%～40% B；16～20 min，40%～15% B；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：20 ?L。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

準(zhǔn)確稱取烘干至質(zhì)量恒定的標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚各1 mg，用甲醇定容至10 mL，制成100 ?g/mL的儲備液作為對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取各對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 ?L定容至1 mL，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 儀器方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)

精密度：準(zhǔn)確吸取兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚混合對照品溶液16 μL，按1.3.2節(jié)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，分析儀器的精密度。

重復(fù)性：按1.3.1節(jié)方法平行制備6份供試溶液，按1.3.2節(jié)色譜條件進(jìn)樣，分析實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。

穩(wěn)定性：將供試溶液分別在室溫放置0、2、4、6、8、10 h；按1.3.2節(jié)色譜條件進(jìn)樣，分析實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。

1.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取已知含量的大麥樣品6份，分別精確加入混合對照品溶液1 mL，按1.3.1節(jié)方法制備供試溶液，按1.3.2節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析回收率。

1.3.6 4種黃酮類物質(zhì)的單因素試驗(yàn)

研究以甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和超聲時(shí)間為單因素，考察各因素對4種主要黃酮類物質(zhì)提取率的影響，均提取1次。

1.3.7 一次回歸正交設(shè)計(jì)

綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用一次回歸正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選4種黃酮類物質(zhì)的提取工藝，利用SPSS 19.0和Excel軟件進(jìn)行回歸分析，以4種黃酮類物質(zhì)的提取量為指標(biāo)，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和超聲時(shí)間3個因素對4種黃酮類物質(zhì)提取率的影響，一次回歸正交設(shè)計(jì)的三因素三水平編碼表見表1。

表1 一次回歸正交設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table1 Coded levels for factors used in orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

圖1 4種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（A）和大麥樣品中4種黃酮類物質(zhì)（B）的色譜圖Fig.1 Chromatograms of authentic standards (A) of catechin, myricetin, quercetin and kaempferol and sample (B)

在楊濤等[6]色譜條件的基礎(chǔ)上，通過對色譜柱、流動相及配比等方面進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚的色譜圖峰形好，分離效果較好。兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚的洗脫時(shí)間分別約3.44、10.01、13.51、16.91 min。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖如圖1所示。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

分別精密吸收對照品溶液1、2、8、14、16、20 μL在1.3.2節(jié)條件下依次進(jìn)樣，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程及線性范圍見表2。

表2 4種黃酮類物質(zhì)的回歸方程及線性范圍Table2 Regression equations and linear ranges for four flavonoid compounds

2.3 實(shí)驗(yàn)方法的可靠性

表3 4種黃酮類物質(zhì)的可靠性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Reliability of the method for determining four flavonoid compounds

按1.3.4節(jié)方法分析，由表3可知，兒茶素的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.6%、1.9%和0.8%；楊梅素的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性RSD分別為0.3%、0.9%和1.2%；槲皮素的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性RSD分別為1.2%、2.5%和2.3%；山奈酚的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性RSD分別為0.5%、3.7%和1.5%，表明儀器的精密度好，重復(fù)性較好，在10 h以內(nèi)樣品基本穩(wěn)定，說明實(shí)驗(yàn)方法是可靠的。

2.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Results of recovery tests

以1.3.5節(jié)方法進(jìn)行分析，結(jié)果見表4，兒茶素的平均回收率為95.59%，RSD為3.36%；楊梅素的平均回收率為95.78%，RSD為5.40%；槲皮素的平均回收率為98.89%，RSD為3.02%；山奈酚的平均回收率為100.75%，RSD為2.46%；4種黃酮類物質(zhì)的平均回收率在2.46%～5.40%，說明實(shí)驗(yàn)方法可行。

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對大麥中4種黃酮類物質(zhì)提取量的影響

圖2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對4種黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of methanol concenration on the extraction efficiency of four flavonoid comounds

以料液比1∶40、超聲時(shí)間30 min，其他條件保持不變，分別以甲醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%、100%提取4種黃酮類物質(zhì)，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)對4種黃酮類物質(zhì)提取量的影響，結(jié)果見圖2。

如圖2所示，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，4種黃酮類物質(zhì)的提取量逐漸增加，當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，4種黃酮類物質(zhì)的提取量達(dá)到最大，之后除槲皮素提取率在甲醇體積分?jǐn)?shù)70%～80%范圍略有增加外，隨著體積分?jǐn)?shù)的增大，4種黃酮類物質(zhì)都呈下降趨勢，到甲醇體積為100%時(shí)，4種黃酮類物質(zhì)的提取量降到最低，可能與溶出的一些親脂性成分、色素等物質(zhì)與4種黃酮類物質(zhì)競爭所致，與段中華等[20]研究結(jié)果相似，故選擇體積分?jǐn)?shù)60%的甲醇溶液為提取溶劑。

2.5.2 料液比對大麥中4種黃酮類物質(zhì)提取量的影響

選取60%的甲醇溶液作為提取溶劑，其他條件同2.5.1節(jié)，分別以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）對大麥4種黃酮類物質(zhì)提取量的影響，結(jié)果如圖3所示，隨著溶劑用量的增加，除兒茶素緩慢增加外，楊梅素、槲皮素、山奈酚的提取量減少，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，兒茶素增加到最大，之后雖有少許的增加和減少，但都沒有料液比為1∶20時(shí)的提取量大，而其他3種物質(zhì)一直減少，到料液比為1∶30時(shí)趨于平緩，所以綜合考慮選取料液比為1∶10。

圖3 料液比對4種黃酮提取量的影響Fig.3 Effectof ratio of solid to liquid on the extraction efficiency of four flavonoid compounds

2.5.3 超聲時(shí)間對大麥中4種黃酮類物質(zhì)提取量的影響

圖4 超聲時(shí)間對4種黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of sonication time on the extraction efficiency of four flavonoid compounds

選取60%的甲醇溶液作為提取溶劑，料液比1∶10，其他條件同2.5.1節(jié)，分別考察超聲15、30、45、60 min對大麥中4種黃酮類物質(zhì)提取量的影響，結(jié)果如圖4所示，隨著超聲時(shí)間的延長，先有一個平緩的降低，到30 min降到最低，之后又開始緩慢的上升，到45 min的時(shí)候達(dá)到了最大，之后除兒茶素和楊梅素緩慢下降外，槲皮素和山奈酚基本保持不變，故選取超聲時(shí)間為45 min。

2.6 一次回歸正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方案結(jié)果分析

按1.3.7節(jié)試驗(yàn)編碼因素的試驗(yàn)方案和結(jié)果見表5。

表5 三因素一次正交設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table5 Orthogonal array design and results

表6 兒茶素方差分析表Table6 Variance analysis of catechin

表7 楊梅素方差分析表Table7 Analysis of variance for myricetin

表8 槲皮素方差分析表Table8 Analysis of variance for quercetin

表9 山奈酚方差分析表Table8 Analysis of variance for kaempferol

由表6～9可以看出，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），甲醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對大麥中兒茶素和山奈酚的提取量影響顯著（P＜0.05），料液比對楊梅素和槲皮素的提取量影響顯著，兩因素之間的交互作用不顯著，大麥中4種黃酮類物質(zhì)的提取量與3個因素（含兩兩因素間的交互作用）之間的回歸關(guān)系顯著，R2分別為0.949、0.953、0.963、0.956，說明含兩因素間交互作用的一次回歸模型與實(shí)際情況擬合的較好。在此模型下兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚的回歸方程分別為y=296.98＋3.01x1＋23.1x2＋13.47x3－0.24x1x2－0.22x1x3＋0.01x2x3；y=16.76＋4.79x1－7.60x2＋3.80x3－0.05x1x2－0.06x1x3＋0.43x2x3；y=－196.89＋8.99x1－4.67x2＋9.44x3＋0.24x1x2－0.15x1x3＋0.01x2x3；y=249.33＋0.41x1＋31.10x2+3.05x3－0.38x1x2－0.065x1x3－0.01x2x3。

大麥中4種黃酮類物質(zhì)的最優(yōu)提取條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶20和超聲時(shí)間60 min，各因素對4種物質(zhì)影響的主次順序依次為料液比＞甲醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間。

3 結(jié) 論

該研究利用一次回歸正交優(yōu)化了從大麥中超聲提取4種主要黃酮類物質(zhì)的3個因素，得到回歸模型，兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚的回歸方程并確定最佳的提取工藝條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶20、超聲時(shí)間60 min，該方法準(zhǔn)確，可靠，可應(yīng)用于大麥中4種黃酮類物質(zhì)的同時(shí)提取，為大麥中黃酮類物質(zhì)的深加工提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

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Optimizing an Ultrasound-Assisted Method for Extraction of Four Major Flavonoids in Barley by Using Orthogonal Regression Design

YU Chun-lei, YUAN Jin-e, ZHANG Kun-fei, LUO Xiao-jiao, QI Guo-chang, FENG Zong-yun*
(Barley Research Center, Department of Plant Genetics and Breeding, College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China)

This study was attempted to develop the optimum ultrasound-assisted extraction (UAE) process of the four major fl avonoids catechin, myricetin, quercetin and kaempferol from barley using orthogonal array design and linear regression. The contents of these fl avonoid compounds in extracts were investigated with respect to methanol concentration, solid-tosolvent ratio and sonication time. We proposed an optimized high performance liquid chromatography (HPLC) system to determine the fl avonoids. The analytical method displayed a good linear relationship for all the compounds tested in the range of 0.005 - 0.1 μg, and was stable and reliable. The optimum extraction conditions were found using an extraction solvent consisting of 50% methanol in water with a solid-to-solvent ratio of 1:20 (g/mL) and sonication for 60 min.

barley; HPLC; catechin; myricetin; quercetin; kaempferol

TS210.4；S512.3

A

1002-6630（2014）02-0051-05

10.7506/spkx1002-6630-201402010

2013-04-09

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-05）

余春磊（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榇篼溒焚|(zhì)遺傳育種與分子生物學(xué)。E-mail：564452862@qq.com

*通信作者：馮宗云（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榇篼溸z傳育種與分子生物學(xué)。E-mail：zyfeng49@126.com