蒼晶，范博，宋揚(yáng)，許賀，牟永潮，于晶，張達(dá)，王軍虹，孟婧，朱祥春

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

低溫脅迫下冬小麥東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSR信息分析

蒼晶，范博，宋揚(yáng)，許賀，牟永潮，于晶，張達(dá)，王軍虹，孟婧，朱祥春

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)低溫脅迫相關(guān)基因的cDNA正反文庫(kù)，獲得表達(dá)序列標(biāo)簽EST（Expressed sequence tag），經(jīng)分析和前期處理后拼接得到736條非重復(fù)序列（Unigenes）。運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)低溫脅迫下誘導(dǎo)的冬小麥東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSRs分布頻率和堿基重復(fù)特點(diǎn)進(jìn)行歸納分析。結(jié)果表明，736條Unigenes共檢索到59個(gè)EST-SSRs，EST-SSRs出現(xiàn)頻率為8.02%。EST-SSRs包括24種重復(fù)單元，其主要以三核苷酸和二核苷酸重復(fù)基元為主，二者分別占總SSRs 47.46%和44.07%，在EST中出現(xiàn)頻率分別為3.80%和3.53%，其中以二核苷酸CA和AG重復(fù)基元為主，三核苷酸重復(fù)基元以AAC重復(fù)基元所占比例最高。為冬小麥EST資源開發(fā)和抗寒基因挖掘奠定基礎(chǔ)。

冬小麥；東農(nóng)冬麥1號(hào)；低溫脅迫；分蘗節(jié)；EST；SSR

東農(nóng)冬麥1號(hào)是首例能在黑龍江省高寒地區(qū)越冬的強(qiáng)抗寒冬小麥品種，可耐-30℃低溫，其返青率可達(dá)85%以上。

EST（Expressed sequence tag）和cDNA中均含有SSR，基于EST的SSR（Simple sequence repeat）標(biāo)記是近年發(fā)展起來(lái)的新型分子標(biāo)記，與傳統(tǒng)SSR相比，可反映基因的編碼部分，直接獲得基因表達(dá)信息，為功能基因提供絕對(duì)標(biāo)記，使得對(duì)決定重要性狀的基因進(jìn)行直接鑒定成為可能，從而強(qiáng)化SSR標(biāo)記在遺傳研究中的應(yīng)用。在眾多分子遺傳標(biāo)記方法中，EST-SSR方法具備成本低且簡(jiǎn)單、有效，重復(fù)性好、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)[1]。有關(guān)小麥ESTSSR分析已有報(bào)道[2]，但關(guān)于冬小麥抗寒相關(guān)的EST-SSR尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)低溫脅迫下東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)的EST-SSR進(jìn)行分析，為挖掘冬小麥抗寒基因、輔助抗寒品種選育提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)。探究東農(nóng)冬麥1號(hào)高抗寒的分子機(jī)制及其遺傳背景，對(duì)于進(jìn)一步分子育種，獲得更適宜的優(yōu)質(zhì)抗寒新材料，具有理論意義和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST來(lái)源

東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST來(lái)源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理生化與分子生物學(xué)研究室構(gòu)建的低溫脅迫下東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)的抑制消減雜交文庫(kù)。

1.2 東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST的前期處理

從培養(yǎng)基上挑取白色菌斑進(jìn)行序列測(cè)定。挑取正反文庫(kù)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，成功回收789個(gè)EST，序列長(zhǎng)度介于103～844 bp之間，平均355bp。

1.3 東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST的聚類與去冗余

在處理過(guò)程中可能存在多個(gè)EST代表相同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的情況，這可能是由于特定組織的EST序列會(huì)代表隨機(jī)取樣的各種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。為避免產(chǎn)生冗余ESTs以及使聚類組成獲得質(zhì)量高的長(zhǎng)序列，可使用程序?qū)垲愡M(jìn)行拼接。使用CAP3程序獲得736條unigenes，占全部序列的93.28%。

1.4 東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)EST序列的信息分析

運(yùn)用SSRI軟件http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool在線搜索EST-SSR。搜索標(biāo)準(zhǔn)為：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)大于或等于5。

2 結(jié)果與分析

2.1 東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST中SSR的出現(xiàn)頻率與分布

東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)的EST-SSR類型豐富，二核苷酸至六核苷酸均可被檢索到，但各種重復(fù)類型所占比例和出現(xiàn)頻率各不相同。其中二核苷酸和三核苷酸是主要的重復(fù)類型，分別占總SSR的44.07%和47.46%，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸所占總SSR比例非常小，分別為0.41%、0.14%和0.14%，三者在EST中的出現(xiàn)頻率均未超過(guò)1%（見(jiàn)表1）。

表1 東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSRs出現(xiàn)頻率Table 1 Frequency of EST-SSRs occurred in tillering nodes of Dongnongdongmai 1

2.2 東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSR中重復(fù)基元的特點(diǎn)

在檢索到的59個(gè)EST-SSR中，共包括24種核苷酸重復(fù)基元。其中三核苷酸重復(fù)基元類型最為豐富，共11種，占總核苷酸基元類型的45.83%；其次是二核苷酸基元類型，共8種，占總核苷酸基元類型的33.33%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的基元類型均為1種。二核苷酸基元類型主要以CA為主，AG次之，TC、AT依次減少，TA、GA、CT、GT檢索數(shù)量均為1（見(jiàn)表2）。三核苷酸基元類型主要以AAC比例最高，占三核苷酸總基元含量的28.75%；其次是ACA，占三核苷酸總基元含量的17.86%。其他各基元類型所占比例較分散，由于基元類型較多，各基元所占比例均較低。四、五、六核苷酸基元類型共有5種，每一種基元數(shù)目都較少，因此，在整個(gè)EST中出現(xiàn)頻率也很低。

表2 東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)EST-SSRs重復(fù)類型的出現(xiàn)情況Table 2 Repeat type occurred in EST-SSRs of tillering nodes of Dongnongdongmai 1

2.3 東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSR中重復(fù)基元的分布特點(diǎn)

東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSR多態(tài)性主要是由于重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)、重復(fù)類型以及SSR長(zhǎng)度不同造成。

如表3所示，由于東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)不同致使其EST-SSR呈現(xiàn)多態(tài)性，從而獲得分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSR不同數(shù)目。對(duì)所獲得的EST進(jìn)行SSR檢索時(shí)，以重復(fù)基元最低重復(fù)次數(shù)5為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行檢索共獲得9種重復(fù)次數(shù)。最高重復(fù)次數(shù)達(dá)到13次重復(fù)。重復(fù)5次獲得EST-SSR數(shù)目最多，共29個(gè)，占總SSR數(shù)49.15%，重復(fù)6次獲得EST-SSR數(shù)目為13個(gè)，占總SSR數(shù)22.03%，重復(fù)7次獲得EST-SSR數(shù)目為7個(gè)，占總SSR數(shù)11.86%。其他重復(fù)次數(shù)獲得ESTSSR較少。

表3 東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSRs重復(fù)次數(shù)的出現(xiàn)情況Table 3 Number of repeat occurred in EST-SSR of tillering nodes of Dongnongdongmai 1

3 討論與結(jié)論

對(duì)低溫脅迫下構(gòu)建的東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)的抑制消減雜交文庫(kù)，經(jīng)處理成功得到789條EST，經(jīng)分析和前期處理后拼接得到736條序列中共檢索到ESR-SSR 59個(gè)，出現(xiàn)頻率為8.02%，與其他已研究物種的EST-SSR出現(xiàn)頻率相近。例如水稻4.7%[3]、普通小麥5.4%[4]、銀杏5.97%[5]、百合5.98%[6]、黃瓜7.47%[7]、蝴蝶蘭7.65%[8]、白菜10.34%[9]等。其出現(xiàn)頻率均低于15%。但與某些物種反差較大，例如西瓜53.4%[10]。造成EST-SSR出現(xiàn)頻率不同的原因主要有：SSR檢索時(shí)長(zhǎng)度的不同、物種間SSR間的真實(shí)差異、同一物種間EST來(lái)源于不同組織和器官、不同研究收集的EST數(shù)量不同、現(xiàn)有EST數(shù)據(jù)不足以覆蓋基因組等。

東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)的EST-SSR類型主要以二核甘酸和三核苷酸為主，分別占總SSR的44.07%和47.46%，這與大多數(shù)報(bào)道一致。但由于物種的不同，重復(fù)基元會(huì)存在差異[2]。東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSR分析表明，三核苷酸重復(fù)基元略高于二核苷酸重復(fù)基元，這與梅[11]、甘蔗[12]、煙草[13]、西洋參[14]、中國(guó)板栗[15]、花生栽培種[16]等研究結(jié)果一致。但與荔枝[17]等研究結(jié)果相反。在三核苷酸重復(fù)基元中，主要以AAC和ACA重復(fù)類型為主，分別占三核苷酸重復(fù)基元的28.57%和17.86%，不同植物的三核苷酸重復(fù)基元變化較大。本研究表明，三核苷酸主要是AAC和ACA類型為主，而在水稻和高粱中則以GGC和GCC為主，鵝掌楸則以AAG和CTT為主要重復(fù)基元[18]。二核苷酸重復(fù)基元主要以CA和AG重復(fù)類型居多，分別占二核苷酸重復(fù)基元的34.62%和23.08%，研究表明，這些占優(yōu)勢(shì)的重復(fù)基元可能與其編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的使用頻率較高有關(guān)[19]。GC重復(fù)基元是一種難以檢索到的重復(fù)基元，本文同樣未檢索到GC重復(fù)基元。Rota曾提出若EST-SSR數(shù)目足夠龐大和無(wú)偏倚性，即在于理想狀態(tài)下，由4種不同堿基隨機(jī)組合，以數(shù)學(xué)概率統(tǒng)計(jì)將會(huì)產(chǎn)生2種單核苷酸、4種二核苷酸、10種三核苷酸、33種四核苷酸、102種五核苷酸和350種六核苷酸基本重復(fù)基元類型[2]。本研究對(duì)EST-SSR的分析表明，很多重復(fù)基元出現(xiàn)頻率很低，例如四、五、六核苷酸的重復(fù)基元占全部EST-SSR的比例均不足1%，分別為0.41%、0.14%和0.14%。這些相對(duì)高級(jí)基元的核苷酸重復(fù)都不是東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)的EST-SSR重復(fù)基元的主導(dǎo)類型，表明其EST-SSR確實(shí)存在一定偏差。

結(jié)果分析表明，東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSR中，重復(fù)的基元類型不是很多，共24種，其中三核苷酸基元重復(fù)類型最為豐富達(dá)到11種，占核苷酸基元重復(fù)類型的45.83%，二核苷酸重復(fù)類型8種，四核苷酸3種，五核苷酸1種，六核苷酸1種。

冬小麥EST序列數(shù)量較大，本研究只針對(duì)低溫脅迫下東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSR信息分析，不足以反映冬小麥EST-SSR分布頻率特點(diǎn)及規(guī)律。但研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)與東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSR的信息位點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)，隨著研究深入，對(duì)冬小麥總EST-SSR進(jìn)行全面生物信息學(xué)分析，加快冬小麥EST資源開發(fā)和利用、分子標(biāo)記、遺傳資源評(píng)價(jià)、遺傳作圖、特定形狀的輔助選擇及育種等方面具有重要意義。

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Analysis of EST-SSR information in tillering nodes of winter wheat Dongnongdongmai1 under low temperature stress

CANG Jing,FAN Bo,SONG Yang,XU He,MU Yongchao,YU Jing,ZHANG Da,WANG Junhong,MENG Jing,ZHU Xiangchung
(School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Expressed sequence tags(EST)were obtaineded from positive and negative cDNA library of low temperature stress related genes in Dongnongdongmai1,which was constructed by suppression subtractive hybridization technique.After analysis and pretreatment, the EST were assembled and 736 unigenes were acquired.The distribution frequency and the characteristics of base-repeat of EST-SSRs in tillering nodes of Dongnongdongmai1 under low temperature were summarized and analyzed using the bioinformatics method.The results showed that All of 56 EST-SSRs distributed in 736 unigenes.The frequency of EST-SSRs occurences was 8.02%.These EST-SSRs were composed of 24 kinds repeat motifs and they were basically trinucleotide or dinucleotide repeat motifs.In the total SSRs,the trinucleotide repeat motifs accounted for 47.46%and the dinucleotide repeat motifs accounted for 44.07%.In the total EST frequency,the trinucleotide repeat motifs accountedfor 3.80%and the the dinucleotide repeat motifs accounted for 3.53%.The repeat motif on CA and AG in dinucleotide repeat motifs were the most common motif,and The repeat motif on AAC in trinucleotide repeat motifs accounted for the greatest proportion.All these conclusions will establish the theoretic foundationfordevelopment EST resourceof winterwheat andcoldresistancegeneexcavation.

winter wheat;Dongnongdongmai1;low temperature stress;tillering nodes;EST;SSR

S512.1+1

A

1005-9369（2014）01-0001-05

2012-01-12

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金課題（20112325110003）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目；黑龍江省教育廳青年基金項(xiàng)目（11551067）

蒼晶（1963-），女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锷砩c分子生物學(xué)。E-mail:cangjing2003@163.com

時(shí)間2014-1-9 22:49:15[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.2249.014.html

蒼晶,范博,宋揚(yáng),等.低溫脅迫下冬小麥東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)相關(guān)EST-SSR信息分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(1):1-5. Cang Jing,Fan Bo,Song Yang,et al.Analysis of EST-SSR information in tillering nodes of winter wheat Dongnongdongmai1 under low temperature stress[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):1-5.(in Chinese with English abstract)