喬德亮，孫傳伯，何曉梅，韋傳寶，朱旺生，2

1皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院;2 皖西學(xué)院農(nóng)業(yè)工程設(shè)計(jì)與技術(shù)服務(wù)中心，六安 237012

多糖乃生物體內(nèi)重要的生理活性物質(zhì)之一。多糖提取時(shí)采用常規(guī)的“水提醇沉”法，所需提取溫度較高、提取時(shí)間較長(zhǎng)，而且提取得率也較低。微波輔助提取可以提高多糖的提取得率，此法是高效提取多糖的技術(shù)措施之一，已被廣泛應(yīng)用于多糖的提取中［1，2］。多糖提取過(guò)程中一般需要進(jìn)行脫蛋白處理，脫蛋白的方法主要有Sevag 法、三氯乙酸法以及蛋白酶法等，Sevag 法因其具有反應(yīng)條件溫和、幾乎不破壞多糖結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用［3，4］。

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii Lea)俗稱(chēng)三角蚌、珍珠蚌等，為我國(guó)特有的淡水貝類(lèi)，也是我國(guó)最主要的珍珠養(yǎng)殖母蚌之一，其養(yǎng)殖業(yè)已分布浙江、安徽、湖北、湖南、江蘇、江西、福建等多個(gè)省份。三角帆蚌目前主要用于培育珍珠，但其軟體組織還富含蛋白類(lèi)、多糖類(lèi)物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，具有多種重要用途。已有研究顯示，三角帆蚌多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤等作用［5-7］，但三角帆蚌多糖的微波輔助提取及脫蛋白工藝未見(jiàn)報(bào)道。本文利用微波輔助提取技術(shù)和Sevag 法脫蛋白技術(shù)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)三角帆蚌多糖的提取參數(shù)和蛋白脫除參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為三角帆蚌多糖的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用積累一些資料。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

三角帆蚌購(gòu)于安徽省無(wú)為縣珍珠養(yǎng)殖場(chǎng)，洗凈取其內(nèi)臟組織用乙醇(體積分?jǐn)?shù)為75%)浸泡備用。

微波消解儀(WMX-Ⅲ-A 型，廣東韶關(guān)科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4 型，常州國(guó)華電器有限公司);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Alpha-1500 型，上海譜元儀器有限公司);氣浴恒溫振蕩器(CHA-SA 型，金壇市杰瑞爾電器有限公司)等。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma 公司，其它試劑均為常規(guī)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的微波輔助提取

參照Z(yǔ)hong 等［1］、黎慶濤等［2］報(bào)道的方法稍作修改。取保存?zhèn)溆玫牟牧霞舆m量去離子水進(jìn)行微波處理(水料比5～20 mL/g，微波時(shí)間30～150 s，微波功率270～1350 W)，然后再用20～80 ℃熱水浸提2 h。將浸提液離心(5000 rpm，15 min)取上清液，沉淀物用相同方法再提取2 次，離心(5000 rpm，15 min)取上清液。合并3 次上清液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器50 ℃減壓濃縮至適量，濃縮液加3 倍體積無(wú)水乙醇(乙醇終濃度為75 %)沉淀過(guò)夜，離心(5000 rpm，15 min)取沉淀物，得到水溶性粗提物。粗提物采用Sevag 法脫除游離蛋白，得粗多糖。粗多糖中多糖含量的測(cè)定參照張惟杰［8］報(bào)道的苯酚-硫酸比色法稍作修改，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

在單因素實(shí)驗(yàn)(水料比、提取溫度、微波時(shí)間、微波功率)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)3個(gè)平行，因素水平的確定以多糖提取得率為判斷指標(biāo)。

1.2.2 多糖粗提物中蛋白質(zhì)的Sevag 法脫除

參照朱劼等［3］報(bào)道的方法經(jīng)適當(dāng)修改。取多糖粗提物溶液(約1.0 mg/mL)50 mL，加入一定體積的氯仿-正丁醇混合液(混合液中正丁醇與氯仿體積比例0.15～0.35、混合液用量占多糖溶液的體積百分比15%～35%)，搖床劇烈振蕩10～50 min，分液漏斗靜置30 min 使其分層，去除下層有機(jī)溶劑-蛋白相。上清液用相同方法反復(fù)脫蛋白6～10 次。將上清液定容至50 mL，測(cè)量多糖溶液的蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率。

蛋白去除率的測(cè)定采用紫外吸收法，即利用蛋白質(zhì)在280 nm 處有強(qiáng)吸收的特點(diǎn)，測(cè)量多糖溶液的280 nm 吸光值。多糖保留率的測(cè)定運(yùn)用苯酚-硫酸比色法［8］，測(cè)量反應(yīng)體系的490 nm 吸光值。然后比較脫蛋白前后的吸光值，計(jì)算出蛋白去除率和多糖保留率。

在單因素實(shí)驗(yàn)(正丁醇與氯仿比例、混合液用量、脫蛋白時(shí)間、脫蛋白次數(shù))基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)3個(gè)平行，因素水平的確定以蛋白去除率、多糖保留率為判斷指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)微波輔助提取三角帆蚌多糖提取得率的影響

2.1.1 水料比對(duì)三角帆蚌多糖提取得率的影響

水料比設(shè)置5、10、15 和20 mL/g 四個(gè)梯度，提取溫度、微波時(shí)間及微波功率分別是65 ℃、120 s 和1080 W，此時(shí)水料比對(duì)三角帆蚌多糖得率的影響見(jiàn)如圖1(A)所示。當(dāng)水料比在5～15 mL/g 范圍內(nèi)，隨著水料比的增加，多糖得率顯著增加(P＜0.05);15～20 mL/g 范圍內(nèi)，水料比增加多糖得率差異不顯著(P ＞0.05)。張民等［9］報(bào)道水體積的增加有利于多糖物質(zhì)的溶出和運(yùn)輸，從而可以提高多糖的提取得率，但超過(guò)一定比例后影響并不顯著。本研究結(jié)果與此類(lèi)似。當(dāng)水料比小于15 mL/g 時(shí)，水料比對(duì)三角帆蚌多糖得率的影響呈正向顯著性;當(dāng)水料比大于15 mL/g 時(shí)，水料比對(duì)三角帆蚌多糖得率的影響不顯著。考慮到加水過(guò)多不利于后期的濃縮，所以15 mL/g 被選作后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)水料比的中心點(diǎn)。

2.1.2 提取溫度對(duì)三角帆蚌多糖提取得率的影響

提取溫度設(shè)置20、35、50、65 和80 ℃五個(gè)梯度，水料比、微波時(shí)間及微波功率分別為15 mL/g、120 s和1080 W，此時(shí)提取溫度對(duì)三角帆蚌多糖得率的影響見(jiàn)圖1(B)。當(dāng)提取溫度在20～50 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖得率顯著增加(P＜0.05);50～80 ℃范圍內(nèi)，溫度升高多糖得率差異不顯著(P ＞0.05)。有研究報(bào)道，溫度升高可增加多糖的擴(kuò)散系數(shù)和溶解性，有利于多糖從材料中進(jìn)入提取溶劑內(nèi)，從而可提高多糖的提取得率［10］。但溫度升高一定以后，多糖進(jìn)出材料已接近平衡，多糖的提取得率達(dá)到最大值。繼續(xù)增加溫度，可能引起多糖鏈的水解，提取得率反而下降［11］。本研究結(jié)果，當(dāng)溫度小于50 ℃時(shí)，提取溫度對(duì)三角帆蚌多糖得率的影響呈正向顯著性;當(dāng)溫度大于50 ℃時(shí)，提取溫度對(duì)三角帆蚌多糖得率的影響不顯著。所以為了節(jié)約能源和成本，50 ℃被選作后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)提取溫度的中心點(diǎn)。

2.1.3 微波時(shí)間對(duì)三角帆蚌多糖提取得率的影響

研究顯示，一定范圍內(nèi)提取時(shí)間與多糖得率呈正相關(guān)，即時(shí)間的延長(zhǎng)可提高多糖的得率［12］。但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能引起多糖結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致多糖得率減少［13］。本研究微波時(shí)間設(shè)置30、60、90、120 和150 s 五個(gè)梯度，水料比、提取溫度及超聲功率數(shù)分別是15 mL/g、65 ℃和1080 W，此時(shí)微波時(shí)間對(duì)三角帆蚌多糖得率的影響如圖1(C)所示。微波時(shí)間在30～120 s 范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率呈逐漸增加趨勢(shì);120～150 s 范圍內(nèi)，時(shí)間延長(zhǎng)多糖得率呈下降趨勢(shì)。所以，120 s 被選作后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)微波時(shí)間的中心點(diǎn)。

2.1.4 微波功率對(duì)三角帆蚌多糖提取得率的影響

微波功率設(shè)置270、540、810、1080 和1350 W 五個(gè)梯度，水料比、提取溫度及微波時(shí)間分別是15 mL/g、65 ℃和120 s，此時(shí)微波功率對(duì)三角帆蚌多糖得率的影響見(jiàn)圖1(D)。當(dāng)微波功率在270～1080 W 范圍內(nèi)，隨著功率的增加，多糖提取得率呈逐漸增加趨勢(shì);1080～1350 W 范圍內(nèi)，功率的增加多糖得率呈下降趨勢(shì)。所以，1080 W 被選作后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)微波功率的中心點(diǎn)。

圖1 水料比(A)、溫度(B)、微波時(shí)間(C)及微波功率(D)對(duì)三角帆蚌多糖提取得率的影響Fig.1 Effect of ratio of water to raw material (A)，extraction temperature (B)，microwave duration (C)and microwave power (D)on the yield of H.cumingii polysaccharides

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化三角帆蚌多糖的提取參數(shù)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行4 因素3 水平的正交實(shí)驗(yàn)，以多糖提取得率為指標(biāo)，對(duì)三角帆蚌多糖的微波輔助提取條件進(jìn)行優(yōu)化。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果列于表1。由表中極差值大小可知，提取溫度對(duì)三角帆蚌多糖的提取得率影響最大，其次分別為微波時(shí)間、水料比和微波功率，即各因素影響的大小順序?yàn)锽 ＞C ＞A ＞D。從表中均值大小可以看出，提取條件的最佳組合為A2B2C3D2。

取3 份三角帆蚌樣品，以最佳條件組合(A2B2C3D2)進(jìn)行多糖微波輔助提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果多糖的提取得率為4.06%，略高于表中最優(yōu)組合(A2B2C3D1)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(3.99%)。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析列于表2。由表2 可知，四個(gè)因素(水料比、提取溫度、微波時(shí)間、微波功率)對(duì)多糖提取得率的影響都是顯著的。所以，最終確定三角帆蚌多糖微波輔助提取條件的最優(yōu)組合為A2B2C3D2，即水料比15 mL/g、提取溫度50 ℃、微波時(shí)間150 s、微波功率1080 W。

表1 三角帆蚌多糖微波輔助提取的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=3，)Table 1 Design matrix and results of orthogonal experiment for the microwave-assisted extraction of H.cumingii polysaccharides (n=3，)

表1 三角帆蚌多糖微波輔助提取的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=3，)Table 1 Design matrix and results of orthogonal experiment for the microwave-assisted extraction of H.cumingii polysaccharides (n=3，)

表2 三角帆蚌多糖微波輔助提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiment results for the microwave-assisted extraction of H.cumingii polysaccharides

2.3 三角帆蚌多糖Sevag 法脫蛋白單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 正丁醇與氯仿比例對(duì)三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影響

正丁醇與氯仿體積比設(shè)置0.15、0.20、0.25、0.30 和0.35 五個(gè)梯度，混合液用量、脫蛋白時(shí)間及脫蛋白次數(shù)分別是30%、40 min 和8 次，此時(shí)正丁醇與氯仿比例對(duì)三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影響如圖2(A)所示。正丁醇與氯仿比例為0.35 時(shí)，蛋白去除率最高，但多糖損失嚴(yán)重，多糖保留率很低;正丁醇與氯仿比例為0.20 時(shí)，蛋白去除率和多糖保留率均較高。所以，0.20 被選作后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)正丁醇與氯仿比例的中心點(diǎn)。

2.3.2 混合液用量對(duì)三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影響

正丁醇-氯仿混合液用量占多糖溶液的體積百分比設(shè)置15%、20%、25%、30%和35%五個(gè)梯度，正丁醇與氯仿比例、脫蛋白時(shí)間及脫蛋白次數(shù)分別是0.25、40 min 和8 次，此時(shí)混合液用量對(duì)三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影響如圖2(B)所示?；旌弦河昧繛?0%時(shí)，蛋白去除率最高，但多糖損失嚴(yán)重，多糖保留率低;混合液用量為35%時(shí)，多糖保留率最高，但蛋白質(zhì)保留的也多，蛋白去除率低;混合液用量為15%時(shí)，蛋白去除率、多糖保留率均較高。所以，15%被選作后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)混合液用量的中心點(diǎn)。

圖2 正丁醇與氯仿比例(A)、混合液用量(B)、脫蛋白時(shí)間(C)、脫蛋白次數(shù)(D)對(duì)三角帆蚌多糖蛋白去除率和多糖保留率的影響Fig.2 Effect of ratio of n-butyl alcohol to chloroform (A)，dosage of mixture (B)，deproteinization duration (C)and times of deproteinization (D)on the protein removal percentage and polysaccharide remaining percentage of H.cumingii polysaccharides

2.3.3 脫蛋白時(shí)間對(duì)三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影響

脫蛋白時(shí)間設(shè)置10、20、30、40 和50 min 五個(gè)梯度，正丁醇與氯仿比例、混合液用量及脫蛋白次數(shù)分別是0.25、30%和8 次，此時(shí)脫蛋白時(shí)間對(duì)三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影響如圖2(C)所示。脫蛋白時(shí)間為10 min 時(shí)，蛋白去除率最高，但多糖保留率也是最低;脫蛋白時(shí)間為20 min 時(shí)，蛋白去除率、多糖保留率均較高。所以，20 min 被選作后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)脫蛋白時(shí)間的中心點(diǎn)。

2.3.4 脫蛋白次數(shù)對(duì)三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影響

脫蛋白次數(shù)設(shè)置6、7、8、9 和10 次五個(gè)梯度，正丁醇與氯仿比例、混合液用量及脫蛋白時(shí)間分別是0.25、30%和40 min，此時(shí)脫蛋白次數(shù)對(duì)三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影響如圖2(D)所示。脫蛋白次數(shù)在6～10 次范圍內(nèi)，隨著次數(shù)的增加，蛋白去除率呈逐漸增加趨勢(shì)、多糖保留率呈逐漸減少趨勢(shì)。脫蛋白次數(shù)為9 次時(shí)，蛋白去除率、多糖保留率均較高。所以，9 次被選作后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)脫蛋白次數(shù)的中心點(diǎn)。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化三角帆蚌多糖的脫蛋白參數(shù)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行4 因素3 水平的正交實(shí)驗(yàn)，以蛋白去除率、多糖保留率為指標(biāo)，對(duì)三角帆蚌多糖的Sevag 法脫蛋白條件進(jìn)行優(yōu)化。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果列于表3。由表中極差值大小可知:影響蛋白去除率的主要因素為正丁醇與氯仿比例，其次是脫蛋白次數(shù)、混合液用量和脫蛋白時(shí)間;影響多糖保留率的主要因素為脫蛋白次數(shù)，其次是正丁醇與氯仿比例、混合液用量和脫蛋白時(shí)間。

表3 三角帆蚌多糖脫蛋白的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=3，)Table 3 Design matrix and results of orthogonal experiment for the deproteinization of H.cumingii polysaccharides (n=3，)

表3 三角帆蚌多糖脫蛋白的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=3，)Table 3 Design matrix and results of orthogonal experiment for the deproteinization of H.cumingii polysaccharides (n=3，)

有研究報(bào)道，Sevag 法脫蛋白時(shí)重復(fù)處理，隨著蛋白去除率的逐漸增加，多糖保留率會(huì)逐漸下降。分析可能原因:Sevag 試劑處理形成的凝膠物中夾帶有多糖物質(zhì);有些多糖與蛋白結(jié)合形成的糖蛋白也會(huì)發(fā)生凝聚沉淀。這樣導(dǎo)致多糖保留率的下降［14］。本研究結(jié)果顯示與此類(lèi)似。從表3 中均值大小可以看出，蛋白去除率的最佳組合為A2B2C3D3，多糖保留率的最佳組合為A3B1C1D1。對(duì)蛋白去除率和多糖保留率進(jìn)行綜合分析:A 因素取水平1 時(shí)，得到中等的蛋白去除率、低等的多糖保留率;取水平2 時(shí)，得到高等的蛋白去除率、中等的多糖保留率;取水平3 時(shí)，得到低等的蛋白去除率、高等的多糖保留率;所以因素A 取水平2 最適宜。B 因素取水平1 時(shí)，得到低等的蛋白去除率、高等的多糖保留率;取水平2 時(shí)，得到高等的蛋白去除率、低等的多糖保留率;取水平3 時(shí)，得到中等的蛋白去除率、中等的多糖保留率;所以因素B 取水平3 最適宜。C 因素取水平1 時(shí)，得到中等的蛋白去除率、高等的多糖保留率;取水平2 時(shí)，得到低等的蛋白去除率、中等的多糖保留率;取水平3 時(shí)，得到高等的蛋白去除率、低等的多糖保留率;所以因素C 取水平1 最適宜。D 因素取水平1 時(shí)，得到中等的蛋白去除率、高等的多糖保留率;取水平2 時(shí)，得到低等的蛋白去除率、中等的多糖保留率;取水平3 時(shí)，得到高等的蛋白去除率、低等的多糖保留率;所以因素D 取水平1 最適宜。這樣，綜合考慮蛋白去除率和多糖保留率，確定A2B3C1D1為最佳脫蛋白工藝條件。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析列于表4。由表4 可知，四個(gè)因素(正丁醇與氯仿比例、混合液用量、脫蛋白時(shí)間、脫蛋白次數(shù))對(duì)蛋白去除率、多糖保留率的影響都是顯著的。所以，確定三角帆蚌多糖Sevag法脫蛋白條件的最優(yōu)組合為A2B3C1D1，即正丁醇與氯仿比例為0.20，混合液用量為20%，脫蛋白時(shí)間為10 min，脫蛋白次數(shù)為8 次。取3 份三角帆蚌多糖粗提物溶液，以最優(yōu)條件組合(A2B3C1D1)進(jìn)行Sevag 法脫蛋白的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果多糖的蛋白去除率為52.24%、多糖保留率為65.13%。

表4 三角帆蚌多糖脫蛋白正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment results for the deproteinization of H.cumingii polysaccharides

3 結(jié)論

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了微波輔助提取三角帆蚌多糖的工藝條件，最優(yōu)參數(shù)組合為:水料比15 mL/g、提取溫度50 ℃、微波處理時(shí)間150 s、微波功率1080 W。在此條件下，三角帆蚌多糖的提取得率為4.06%。同時(shí)也優(yōu)化了三角帆蚌多糖Sevag 法脫蛋白的工藝參數(shù)，最優(yōu)脫蛋白條件為:正丁醇與氯仿體積比0.20、正丁醇-氯仿混合液用量占多糖溶液的體積百分比20%、脫蛋白振搖時(shí)間10 min、脫蛋白次數(shù)8 次。在此條件下，三角帆蚌多糖的蛋白去除率為52.24%、多糖保留率為65.13%。

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