周學(xué)利，吳銳銳，李小金，方國躍

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥230031；2.安徽省種畜禽質(zhì)量測定站，安徽 滁州239083）

發(fā)酵床養(yǎng)豬模擬原始的動(dòng)物、植物和微生物共生的生態(tài)系統(tǒng)，在豬舍內(nèi)鋪設(shè)一定厚度的谷殼、鋸末和秸稈等富含纖維的植物，混以“發(fā)酵床專用益生菌”，豬排出的糞尿在墊料中經(jīng)微生物發(fā)酵降解、消化，從而達(dá)到豬舍免沖洗、糞尿無排出、限藥無公害的節(jié)約、保暖、環(huán)保和健康等目的［1-4］。我國自起源國引入該項(xiàng)技術(shù)［5-6］，相繼在江蘇、福建、山東等地研究推廣并取得了較好的成果［7］。

發(fā)酵床養(yǎng)豬符合豬的生活習(xí)性，是目前飼養(yǎng)管理難度最高、養(yǎng)殖技術(shù)最先進(jìn)、圈舍造價(jià)最低廉，以及健康、環(huán)保理念最科學(xué)的一種生態(tài)養(yǎng)豬模式。一些豬場由于在認(rèn)知、墊料配制、管理技術(shù)、設(shè)施和責(zé)任心等方面的不足，往往難以真正掌握發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)，出現(xiàn)許多“死床”或者“準(zhǔn)死床”，霉菌、寄生蟲及致病菌容易在墊料中增殖［8-11］。

因此，在不考慮環(huán)保成本的前提下，發(fā)酵床養(yǎng)豬模式在國內(nèi)越來越受到試用者多方面的質(zhì)疑。持反對(duì)觀點(diǎn)的人尤其擔(dān)心墊料中的有害微生物會(huì)打破豬腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡體系，從而引發(fā)疾病。針對(duì)環(huán)境中細(xì)菌的致病性這一焦點(diǎn)問題，鄭雪芳等發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床墊料對(duì)各種大腸桿菌的生防效果隨發(fā)酵床使用時(shí)間的延長而增加［12］；伍清林等的研究結(jié)果顯示，動(dòng)物園各種健康動(dòng)物的生活環(huán)境（空氣、土壤和水）中均廣泛存在致病菌與非致病菌［13］，而且同種細(xì)菌在不同種動(dòng)物的環(huán)境中含量存在差異［14］，表明不同動(dòng)物與其環(huán)境中的細(xì)菌之間存在抑制性和適應(yīng)性。

為了進(jìn)一步了解發(fā)酵床墊料與豬腸道中各種細(xì)菌的分布，以及墊料與豬腸道之間的細(xì)菌是否存在相關(guān)性，我們采集了某發(fā)酵床養(yǎng)殖場不同日齡豬只的腸道內(nèi)容物以及不同飼養(yǎng)階段的發(fā)酵床墊料，分析了所采樣品中的細(xì)菌種類和數(shù)量，檢測了分離菌株的致病性和致病菌株的耐藥性，以期為發(fā)酵床養(yǎng)殖模式的疫病防控提供依據(jù) 。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用20 g昆明小鼠，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。胰蛋白胨大豆瓊脂平板（TSA）、胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基（TSB）、血平板、麥康凱平板、生理鹽水、PBS緩沖液（p H 7.2），參照文獻(xiàn)［15］由實(shí)驗(yàn)室自制。微量生化反應(yīng)管、革蘭氏染液，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 樣品采集與保存

無菌采集某發(fā)酵床養(yǎng)豬場健康乳豬、保育豬和肥育豬新鮮的腸道內(nèi)容物各15份，以及相應(yīng)產(chǎn)房、保育舍、肥育舍的發(fā)酵床床面下30 cm處墊料各15份，置4℃冰箱保存。

1.3 墊料與腸容物的細(xì)菌分離

將每份樣品取0.5 g分別置于滅菌離心管內(nèi)，向離心管內(nèi)各加入1 m L生理鹽水，混合均勻，用接種環(huán)蘸取每個(gè)樣品浸出液劃線接種于2個(gè)TSA平板，分別置37℃厭氧、需氧培養(yǎng)18～36 h，對(duì)不同形態(tài)的菌落進(jìn)行染色、鏡檢，用TSA平板純化細(xì)菌，以血平板或麥康凱平板等進(jìn)行鑒別培養(yǎng)。

1.4 分離菌生化鑒定

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定書冊(cè)》，用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管鑒定分離到的不同細(xì)菌。

1.5 墊料與腸容物的細(xì)菌計(jì)數(shù)

隨機(jī)選取1.3制備的每種豬齡腸容物浸出液3個(gè)、每種豬舍墊料浸出液3個(gè)，用生理鹽水倍比稀釋，每個(gè)稀釋度涂布2塊TSA平板，每板100μL稀釋液，分別置37℃ 厭氧、需氧培養(yǎng)18～36 h，根據(jù)菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，分析樣品中的細(xì)菌濃度。

1.6 分離菌株致病性試驗(yàn)

將發(fā)酵床墊料中分離純化的不同菌株分別接種于5 m L TSB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)8～12 h，分別取10μL培養(yǎng)液接種于15 m L TSB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8～12 h后，取10 m L培養(yǎng)液于滅菌試管內(nèi)4 000 r／min離心5 min，用滅菌PBS液重懸。倍比稀釋菌懸液，采用平板涂布法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；用PBS液將菌懸液稀釋成1×108CFU／m L，取0.5 m L稀釋液腹腔注射小鼠，每種菌株注射1只，5只對(duì)照組小鼠每只腹腔注射無菌PBS液0.5 m L。記錄小鼠的發(fā)病情況，及時(shí)從死亡小鼠的肝臟分離鑒定病原菌。

1.7 主要病原菌耐藥性檢測

用藥敏紙片法檢測1.6確定的致病菌的耐藥性，分析致病菌的耐藥譜和敏感藥物。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌生化鑒定

主要分離到6種細(xì)菌，生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》分別鑒定為大腸桿菌、沙門氏菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黏液性枯草芽孢桿菌。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果Table 1 Biochemical identification results of isolates

2.2 墊料與腸容物細(xì)菌分離結(jié)果

厭氧培養(yǎng)和需氧培養(yǎng)得到的細(xì)菌基本相同。各試驗(yàn)樣品中分離到的細(xì)菌，種類相同，但同種細(xì)菌在不同樣品中的含量存在差異。分離到的細(xì)菌種類主要為大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、葡萄球菌、普通枯草芽孢桿菌和黏液性枯草芽孢桿菌（見表2）。

表2 豬腸容物和墊料的細(xì)菌分離株數(shù)Table 2 The number of bacteria isolated from intestinal contents and pad material

在不同年齡豬腸容物中，大腸桿菌的分離率為100%，糞鏈球菌的分離率為84.4%，這兩種細(xì)菌都是腸道內(nèi)的正常微生物，致病力不強(qiáng)，其數(shù)量雖然較多但一般都會(huì)維持在正常的范圍內(nèi)。盡管葡萄球菌的分離率在53.3%以上，但金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的分離率較低，這兩種細(xì)菌雖然毒力較強(qiáng)，但在健康動(dòng)物腸道內(nèi)常維持低濃度水平，只有在腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡遭到破壞時(shí)，才會(huì)過度繁殖而致病。

在發(fā)酵床墊料中，大腸桿菌的分離率為100%，這可能是由于糞便直接排放到墊料中的緣故；空氣中常見的葡萄球菌在保育豬腸容物、保育舍墊料以及肥育舍墊料中的分離率均高達(dá)100%；墊料中鏈球菌的分離率，產(chǎn)仔舍為46.7%，保育舍為66.7%，肥育舍為33.3%，均低于腸容物中的分離率。環(huán)境中普遍存在的枯草芽孢桿菌在墊料中的分離率高達(dá)97.8%；黏液性枯草芽孢桿菌是發(fā)酵床墊料中的主要益生菌，其在產(chǎn)房和保育舍墊料中的分離率均為100%，在肥育舍墊料的分離率降為80%（這可能與肥育期發(fā)酵床管理難度加大，發(fā)酵效率下降有關(guān)），但該菌很難從豬的腸容物中分離到。

2.3 分離菌株的小鼠致病性試驗(yàn)

小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示：大腸桿菌各分離株均能100%致死小白鼠，但菌株的毒力存在差異，同樣注射0.5 m L菌懸液，少數(shù)菌株在接種后6～10 h致死小鼠，多數(shù)菌株在12～14 h致死小鼠。死亡小鼠的肝臟中均可分離出大腸桿菌。分離到的16株沙門氏菌均能在接種后12～18 h 100%致死小鼠，死亡小鼠的肝臟中均可分離出沙門氏菌。分離到的各鏈球菌，接種小鼠36 h后，小鼠均存活，但可以從存活小鼠的肝臟中分離到鏈球菌，表明小白鼠不是鏈球菌致病性試驗(yàn)的模型動(dòng)物。小鼠在接種金黃色葡萄球菌后16～24 h可100%死亡；分離到的灰白色葡萄球菌，少數(shù)菌株的毒力較強(qiáng)可致死小鼠，多數(shù)菌株的毒力較弱，僅使小鼠在接種后出現(xiàn)沉郁。分離到的枯草芽孢桿菌和黏液性枯草芽孢桿菌，分別是環(huán)境中的常在菌和添加到墊料中的益生菌，均無致病性，注射小鼠36 h后小鼠均無異常表現(xiàn)，存活小鼠的肝臟中不能分離到接種菌。

2.4 病原菌的耐藥性檢測

用藥敏紙片法檢測分離菌株中致病菌對(duì)18種常用藥物的耐藥性，結(jié)果見表3。表3表明，大腸桿菌僅對(duì)頭孢曲松鈉、頭孢噻肟和丁胺卡那霉素高度敏感，對(duì)其它藥物均不敏感；沙門氏菌僅對(duì)頭孢曲松鈉、頭孢噻肟和丁胺卡那霉素高度敏感，對(duì)先鋒霉素Ⅵ、左氧氟沙星和恩諾沙星中度敏感，對(duì)其它試驗(yàn)藥物均不敏感，其耐藥譜較廣；金黃色葡萄球菌僅對(duì)頭孢噻肟高度敏感，對(duì)頭孢曲松鈉和紅霉素中度敏感，對(duì)其它試驗(yàn)藥物均不敏感，其對(duì)試驗(yàn)藥物的敏感率僅為5.6%，耐藥譜十分廣泛；豬鏈球菌僅對(duì)先鋒霉素Ⅵ和新霉素高度敏感，對(duì)慶大霉素中度敏感，對(duì)其它試驗(yàn)藥物均不敏感。

3 討 論

3.1 細(xì)菌的廣泛存在性揭示疫病防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

本試驗(yàn)中分離到的大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、葡萄球菌和普通枯草芽孢桿菌為致病菌或非致病菌，它們廣泛存在于發(fā)酵床墊料中和豬腸道內(nèi)，但豬群并不發(fā)病。這與伍清林等［13］報(bào)道的動(dòng)物園各健康動(dòng)物的環(huán)境（空氣、土壤和水）中廣泛存在多種致病菌及非致病菌的研究結(jié)果相一致。表明在動(dòng)物細(xì)菌性傳染病的三個(gè)防控環(huán)節(jié)中，關(guān)鍵的環(huán)節(jié)既不是“控制傳染源”，也不是“切斷傳播途徑”，而是“保護(hù)易感動(dòng)物”，改善其生存環(huán)境，提高動(dòng)物體質(zhì)，維持動(dòng)物體內(nèi)的和環(huán)境中的致病菌與非致病菌間的微生態(tài)平衡。

3.2 細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和環(huán)境對(duì)細(xì)菌的選擇性

伍清林等的研究［14］顯示，同一動(dòng)物園內(nèi)不同品種動(dòng)物的生活環(huán)境中，生存的細(xì)菌種類相似但同種細(xì)菌在數(shù)量上存在較大差異，表明環(huán)境對(duì)細(xì)菌的生長具有抑制性和選擇性，同時(shí)也表明細(xì)菌對(duì)環(huán)境具有一定的適應(yīng)性。該研究與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。

表3 病原菌的耐藥性檢測結(jié)果Table 3 Test results of antimicrobial resistance of pathogenic bacteria

本試驗(yàn)中，不同年齡豬的腸道內(nèi)容物以及不同圈舍的發(fā)酵床墊料分離到的細(xì)菌種類相同，這表明在發(fā)酵床養(yǎng)豬的過程中，墊料中的細(xì)菌來自空氣、植物碎屑和豬腸道內(nèi)容物，豬腸道內(nèi)容物中的細(xì)菌主要來自墊料、飼料和細(xì)菌的早期定植，空氣中的細(xì)菌主要來自墊料和豬腸道。墊料、豬腸道和空氣三者之間，除了普遍存在葡萄球菌、大腸桿菌這兩種細(xì)菌之外，其它細(xì)菌的數(shù)量差異較大，三者之間的細(xì)菌數(shù)量均不成正相關(guān)。墊料中鏈球菌的數(shù)量低于豬腸道，大腸桿菌的數(shù)量略低于豬腸道；而墊料中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黏液性枯草芽孢桿菌在數(shù)量上則顯著高于豬腸道。豬腸容物和墊料中的細(xì)菌（包括有益菌和有害菌），在種類上基本相同，但在構(gòu)成比例上不同，表明墊料中各種細(xì)菌的數(shù)量比例不能影響腸道中各種菌群的數(shù)量比例。同一種細(xì)菌（例如鏈球菌或沙門氏菌）在不同年齡豬的腸道內(nèi)數(shù)量不等，表明腸道（環(huán)境）能根據(jù)不同日齡豬消化吸收的需要，來選擇性調(diào)整和控制腸道內(nèi)一種或多種細(xì)菌的數(shù)量；不同種細(xì)菌在腸道內(nèi)的數(shù)量不盡相同，也表明環(huán)境對(duì)定植的細(xì)菌具有選擇性；一種細(xì)菌并非能在豬腸道或墊料中肆意生長，會(huì)有其它細(xì)菌和目前尚不明確的因素有效地控制各種細(xì)菌的濃度，保持健康、合適的微生態(tài)平衡，直至環(huán)境發(fā)生較大的改變。盡管墊料中某種細(xì)菌的數(shù)量較多，但并不能提高該種細(xì)菌在腸道內(nèi)的濃度與數(shù)量，表明腸道中各種細(xì)菌的數(shù)量及其比例不受外界環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量或種類的影響。鏈球菌在豬腸道中的分離率顯著高于墊料，表明細(xì)菌對(duì)環(huán)境具有適應(yīng)性和選擇性，腸道中的主要致病菌并非都能在墊料中很好地適應(yīng)、生存和大量繁殖；反之亦然，墊料中的有害微生物即使?jié)舛群芨?，但其在豬腸道中的含量不一定也高，表明墊料中的細(xì)菌不一定都適于在豬腸道中生存和造成危害。

3.3 豬腸道中有害菌對(duì)豬群健康的影響

腸道內(nèi)分離到的致病性細(xì)菌都是腸道內(nèi)的正常微生物，其與腸道內(nèi)的其它微生物共同維系機(jī)體的正常生理機(jī)能和腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡。實(shí)踐表明，有不少發(fā)酵床養(yǎng)殖場的豬群發(fā)病率極低，說明墊料和腸道中的致病菌并不能使豬發(fā)病。如大腸桿菌是最常見的細(xì)菌，也是常見的病原菌，但卻是豬腸道內(nèi)的正常微生物之一。盡管墊料和豬腸道中大量存在大腸桿菌，但豬群一般并不發(fā)病。

3.4 發(fā)酵床養(yǎng)豬對(duì)病原菌耐藥性的影響

分離菌株的耐藥性檢測結(jié)果表明，豬群自身攜帶（腸道內(nèi)）的致病菌和環(huán)境中的致病菌，其耐藥性均較強(qiáng)，這也反映出細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的普遍性。發(fā)酵床養(yǎng)豬是近年才興起的一種節(jié)水、環(huán)保的養(yǎng)豬新技術(shù)，該技術(shù)還未被廣泛接受和應(yīng)用；而且該技術(shù)要求限制使用抗生素。因此，發(fā)酵床養(yǎng)豬場中細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，應(yīng)當(dāng)歸咎于傳統(tǒng)的規(guī)?；B(yǎng)豬模式中藥物的持續(xù)使用、過量使用和其它方式的不規(guī)范使用。傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式過度依賴抗生素，隨著細(xì)菌耐藥性的普遍增強(qiáng)，傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式在疾病防控方面將受到越來越嚴(yán)重的制約。既然抗生素對(duì)耐藥的細(xì)菌收效甚微，用藥與不用藥的差別不明顯，因此在疾病防控方面就不必?fù)?dān)心發(fā)酵床養(yǎng)豬過程中對(duì)抗生素的限用。限用抗生素，會(huì)降低細(xì)菌的耐藥性，減少豬肉中的藥物殘留。發(fā)酵床養(yǎng)豬是有效克服細(xì)菌耐藥性的健康養(yǎng)殖模式，豬場細(xì)菌的耐藥性也有望就此得到逐步改觀。

3.5 發(fā)酵床管理對(duì)豬群健康的影響

發(fā)酵床養(yǎng)殖模式設(shè)計(jì)的墊料厚度及墊料成分，非常適宜益生菌的繁殖，益生菌成為優(yōu)勢菌群，并能發(fā)酵墊料中的豬糞污，其發(fā)酵產(chǎn)生的高溫可以抑制其它細(xì)菌（包括致病菌）及寄生蟲的繁殖，促使豬在發(fā)酵床上健康成長［2，16］。正常的發(fā)酵床墊料可以抑制大腸桿菌特別是攜帶毒素基因的大腸桿菌的生長，且對(duì)大腸桿菌的生防效果隨發(fā)酵床使用時(shí)間的延長而增加［12］。在發(fā)酵床養(yǎng)殖的過程中，飼養(yǎng)員如果沒有掌握相應(yīng)技術(shù)，或者責(zé)任心不強(qiáng)，就會(huì)造成發(fā)酵床的濕度不當(dāng)、發(fā)酵不充分和溫度偏低，導(dǎo)致發(fā)酵床對(duì)豬不再舒適，益生菌被抑制，致病菌大量繁殖。只要管理不當(dāng)，發(fā)酵床就不再是豬生活的良好環(huán)境，豬的抗病力必然下降，發(fā)酵床中的病原菌也會(huì)大量滋生，此時(shí)即便補(bǔ)充益生菌也收效甚微，豬群會(huì)因病原菌的大量侵入而發(fā)病。因此發(fā)酵床養(yǎng)殖過程中的飼養(yǎng)管理與環(huán)境控制至關(guān)重要［17］。

3.6 本研究尚待解決的問題

本研究比較了發(fā)酵床模式中墊料和豬腸容物間菌群的相關(guān)性，有待進(jìn)一步比較同一個(gè)養(yǎng)豬場內(nèi)，發(fā)酵床模式與傳統(tǒng)飼養(yǎng)模式下相同日齡豬舍的豬腸容物、墊料和水泥地面或漏縫板的細(xì)菌分布情況。本試驗(yàn)表明，盡管發(fā)酵床墊料與豬腸容物內(nèi)的致病性細(xì)菌含量高，但豬群并不僅僅因?yàn)楦腥玖舜罅恐虏【蜕钤谥虏【沫h(huán)境中就發(fā)??；尚須研究因發(fā)酵床管理不當(dāng)導(dǎo)致發(fā)病的豬舍中墊料與豬腸容物內(nèi)的細(xì)菌分布情況。

4 小 結(jié)

發(fā)酵床墊料和豬腸容物中含有的細(xì)菌種類基本相同，但含量差異較大，表明細(xì)菌與環(huán)境之間具有雙向的適應(yīng)性和選擇性。發(fā)酵床豬舍墊料和豬體內(nèi)含有一定量的致病菌，有潛在發(fā)病威脅。發(fā)酵床是目前節(jié)水、環(huán)保的養(yǎng)豬模式，對(duì)技術(shù)及飼養(yǎng)員責(zé)任心要求高，特別是在高溫高濕的地區(qū)或季節(jié)。

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