顧 健 李 聰 敖華飛 阮清偉 孔德秋

老年性聾又稱年齡相關(guān)性聽力下降，主要指隨著年齡的增長，在排除噪音、耳毒性藥物和遺傳因素的參與情況下，聽覺器官隨同身體其他組織器官一起發(fā)生的老化過程，主要表現(xiàn)為雙耳漸進(jìn)性對稱性的感音神經(jīng)性聽力損失，以高頻聽力下降為主，伴言語識別率降低等［1］。但迄今為止，老年性聾的防治仍然是尚未解決的難題，近年來最重要的進(jìn)展是認(rèn)同氧化應(yīng)激。石杉堿甲素有“植物中的黃金”之稱，已經(jīng)在臨床上用于治療阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病［2，3］。故本實(shí)驗(yàn)組擬通過注射D－半乳糖模擬機(jī)體衰老機(jī)制制備老年性聾模型，具體觀察石杉堿甲是否具有局部抗炎作用。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動物:清潔級 SD雄性大鼠30只，體重為220～250g，購自上海復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部，合格證編號:［SCXK(滬)2009－0019］2009001918815，無噪聲暴露和藥物使用史，耳廓反射靈敏，電子耳鏡檢查外耳道、鼓膜均無異常。

2．實(shí)驗(yàn)試劑:D－半乳糖(D－gal)購于美國Sigma公司;石杉堿甲(Hup A)購于上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司(批號:090504);小鼠抗人S－100單克隆抗體、NF－кBp65購于Santa ckuz Biotechnology Inc公司。

3．模型制備及分組:所選的SD大鼠在清潔安靜的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)平均分為3組，均行頸背部皮下連續(xù)注射8周。D－gal組給予5%D－半乳糖(200mg/kg);D－gal+HupA組予5%D－半乳糖(200mg/kg)和石杉堿甲(0．1mg/kg)配成與模型組同體積溶液;對照組(control組)予以同體積生理鹽水。

4．組織準(zhǔn)備:上述模型制備后將各組的SD大鼠經(jīng)戊巴比妥(80mg/kg)腹腔注射麻醉，開胸后用4%的多聚甲醛行心臟灌注。后迅速斷頭，取出耳蝸，放入4%的多聚甲醛中固定，4℃過夜;常規(guī)行10%的EDTA脫鈣2周;后行梯度浸糖，先浸入15%蔗糖溶液，再浸入30%蔗糖溶液，至組織塊下沉。所有組織塊均在液氮中保存，在－20℃的恒冷切片機(jī)上以5μm連續(xù)冠狀切片，制作冷凍切片。

5．免疫熒光染色:取各組不同SD大鼠的的冷凍切片置于室溫下30min，入4%的丙酮固定10min，0．01mol/L PBS漂洗5min×3次;用3%過氧化氫孵育5min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;再用0．01mol/L PBS漂洗5min×3次;10%羊血清封閉 30min，傾去不洗，滴加 1抗(1∶100)，4℃過夜，次晨37℃復(fù)溫1h，PBS漂洗5min×3 次;滴加 2抗(1∶100)，37℃孵育 60min，滴加 SABC 復(fù)合物(1∶100)，37℃孵育30min，PBS 漂洗5min×3次，加DAB顯色5min，終止反應(yīng)，雙蒸水充分洗滌，常規(guī)脫水、透明、封片。

6．定量RT－PCR分析:總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄為cDNA所需試劑由美國Invitrogen公司提供。使用SYBR Premix RT－PCR試劑盒，根據(jù)制造商的說明進(jìn)行PT－PCR操作。引物序列列表見表1。

表1 定量RT－PCR所用的引物列表

7．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 17．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)描述采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，采用t檢驗(yàn)對計(jì)量資料進(jìn)行組間比較，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．石杉堿甲阻止施萬細(xì)胞的激活、阻止NF－κB的活化:S－100標(biāo)記的施萬細(xì)胞及NF－κB的免疫熒光染色如下圖1所示，由圖可知。3組大鼠耳蝸組織中S－100標(biāo)記的施萬細(xì)胞和NF－κB增亮影基本重疊，說明在膠質(zhì)細(xì)胞中NF－κB參與細(xì)胞的激活。與對照組(control組)比，D－gal組耳蝸組織中的施萬細(xì)胞和NF－κB均高度顯色，說明此時施萬細(xì)胞被激活，同時NF－κB被活化，即D－半乳糖誘導(dǎo)形成的老年性聾耳蝸內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活。而D－gal+HupA組耳蝸組織中的施萬細(xì)胞和NF－κB均正常顯色，說明D－半乳糖誘導(dǎo)的老年性聾經(jīng)石杉堿甲作用后耳蝸組織的施萬細(xì)胞的激活被抑制。即表明石杉堿甲具有阻止施萬細(xì)胞激活和NF－κB的活化的作用。

2．石杉堿甲抑制D－半乳糖誘導(dǎo)老年性聾的局部炎癥反應(yīng):耳蝸組織中測定的IL－1β、IL－6、TNF－α的含量如下圖2所示。與對照組相比，D－gal組內(nèi)的IL－1β、IL－6、TNF－α明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。而與D－gal+HupA組相比，D－gal組內(nèi)的IL－1β、IL－6、TNF－α也明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

圖1 耳蝸組織中施萬細(xì)胞、NF－κB p65免疫熒光

討 論

老年性聾是人體老化過程在聽覺器官中的表現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，至今還沒有統(tǒng)一的發(fā)病機(jī)制理論［4］。其中線粒體老化計(jì)時假說最引人矚目，該理論認(rèn)為:線粒體氧利用率高，是活性氧的主要亞細(xì)胞來源，當(dāng)活性氧的產(chǎn)生和清除之間失去平衡，就會出現(xiàn)氧化應(yīng)激［5］?；钚匝鯇ι锎蠓肿泳哂泻軓?qiáng)的破壞作用，可導(dǎo)致線粒體DNA、細(xì)胞等廣泛的損傷，內(nèi)源性抗氧化酶減少，線粒體膜穩(wěn)定性破壞，向細(xì)胞釋放細(xì)胞色素C，通過級聯(lián)反應(yīng)激活最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，設(shè)法減少機(jī)體氧自由基的產(chǎn)生、改善抗氧化防御和氧化損傷的修復(fù)功能，將大大提高老年性聾的防治水平。

圖2 耳蝸組織中炎癥因子的RT－PCR

石杉堿甲(HupA)是從草藥蛇足石杉中分離得到的一種新型石松類生物堿有效單體。因其具有易透過血腦屏障、口服生物利用度好、且持續(xù)作用時間更長和外周不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，目前已在臨床上用于阿爾茨海默病(AD)、重癥肌無力、精神分裂癥以及其他神經(jīng)退行性疾病。目前國內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道石杉堿甲有抗炎、抗衰老的作用。故本實(shí)驗(yàn)組就利用石杉堿甲的此優(yōu)點(diǎn)研究其對老年性聾的局部抗炎作用［6，7］。

在前期的實(shí)驗(yàn)中，筆者已經(jīng)通過檢測ABR對各組大鼠的各波潛伏期的變化進(jìn)行了觀察，D－gal+HupA組ABR閾值出現(xiàn)Ⅲ波潛伏期、Ⅰ～Ⅴ波間期縮短，聽覺通路上神經(jīng)傳導(dǎo)加快，表明石杉堿甲可以提高中樞對聲音的加工過程，進(jìn)而推斷這可能與改變軸突脫髓鞘變有關(guān)［8］。在本實(shí)驗(yàn)中為了進(jìn)一步探究此推斷。

施萬細(xì)胞是一種周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，為軸突提供支持并形成髓鞘，其功能極其活躍，可分泌多種活性物質(zhì)，這些物質(zhì)對維持神經(jīng)纖維的存活、生長及再生具有重要的意義。而NF－κB是近年來發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子家族的新成員，是細(xì)胞內(nèi)最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在許多細(xì)胞刺激介導(dǎo)的細(xì)胞信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起核心作用，參與多種基因的表達(dá)和調(diào)控，是細(xì)胞激活的標(biāo)志。NF－κB一般存在于靜息細(xì)胞中，在多種因素激活下進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA模板上的特意蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生和釋放各種細(xì)胞因子。故本實(shí)驗(yàn)將石杉堿甲的局部抗炎作用放眼于施萬細(xì)胞和NF－κB是否激活受抑制，進(jìn)而說明石杉堿甲是否具有對局部神經(jīng)的抗炎、抗氧化作用。

D－gal組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果即可顯示施萬細(xì)胞的激活和NF－κB的活化是一致的，而D－gal+HupA組則明顯受抑制。即表明:石杉堿甲具有抑制施萬細(xì)胞的激活和NF－κB的活化。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探究了NF－κB依賴的炎性因子(如 IL－1β、IL－6、TNF－α)的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性進(jìn)一步說明石杉堿甲的局部抗炎作用。我們即可得石杉堿甲阻止了施萬細(xì)胞、抑制NF－κB的活化，繼而下調(diào)NF－κB依賴的炎性因子(如 IL－1β、IL－6、TNF－α)的表達(dá)。

因此，石杉堿甲對耳蝸組織的局部抗炎作用將有益于老年性聾的臨床治療，然而這一結(jié)論還有待于進(jìn)一步的臨床研究證實(shí)。

1 Seidman MD，Ahmad N，Bai U．Molecular mechanisms of age－related hearing loss［J］．Ageing Res Rev，2002，1(3):331 －343

2 Xiao XQ，Yang JW，Tang XC．Huperzine A protects rat pheochromocytoma cells against hydrogen peroxide－induced injury［J］．Neurosci Lett，1999，275(2):73 －76

3 Xiao XQ，Yang JW，Tang XC．Huperzine A and tacrine attenuate β －anyloid peptide induced oxidative injury［J］．Neurosci Res，2000，61(5):564－569

4 Mitchell P，Gopinath B，Wang JJ，et al．Five － year incidence and progression of hearing impairment in an older population［J］．Ear Hear，2011，32(2):251 －257

5 Moon H，Baek D，Lee B，et al．Soybean ascorbate peroxidase suppresses Bax－induced apoptosis in yeast by inhibiting oxygen radical generation［J］．Biochem Biophys Res Commum，2002，290(1):457－462 6 Ruan Q，Liu F，Gao Z，et al．The anti－inflamm－aging and hepatoprotective effects of huperzine A in D －galactose－treated rats［J］．Mech Aging Dev，2013，134(3 －4):89 －97

7 Wang ZF，Wang J，Zhang HY，et al．Huperzine A exhibits anti－ inflammatory and neuroprotective effects in a rat model of transient focal cerebral is chemia［J］．J Neurochem，2008，106(4):1594 －1603

8 孔德秋，顧健，李聰?shù)龋級A甲對D－半乳糖誘導(dǎo)老年性聾大鼠聽覺功能的影響評估［J］．中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2013，93(19):199－203