侯 麗 沈 波 鄭玉芬 鄭 靜 朱 敏

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，滑膜炎持久反復(fù)發(fā)作，繼而侵犯骨組織，造成關(guān)節(jié)軟骨、骨和關(guān)節(jié)囊的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚，目前已有研究表明遺傳、環(huán)境及免疫調(diào)節(jié)在RA的發(fā)病中具有極為重要的作用，特別是免疫紊亂與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。人類白細(xì)胞抗原－G(human leukocyte antigen G，HLA－G)是近年發(fā)現(xiàn)的自身免疫負(fù)調(diào)控的重要靶標(biāo)，在免疫調(diào)節(jié)及免疫耐受的維系中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，HLA－G不僅可通過與多種免疫活性細(xì)胞上的抑制性受體結(jié)合直接發(fā)揮免疫抑制的作用，還可以通過各種途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)，間接發(fā)揮免疫抑制作用，其異常表達(dá)可導(dǎo)致自身免疫耐受缺失或炎癥紊亂［1，2］。而HLA－G在RA中的功能和作用機(jī)制研究還剛起步，因此，本研究通過ELISA法檢測RA患者血漿sHLA－G水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD3+HLAG+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞含量，分析三者表達(dá)變化及其相關(guān)性及與RA臨床特征的關(guān)系，以探討它們在RA發(fā)病過程中的可能作用，從而進(jìn)一步加深對(duì)RA發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為RA免疫干預(yù)策略提供新的靶向。

材料與方法

1．臨床資料:40例RA患者均系溫州醫(yī)科大學(xué)附屬浙江省臺(tái)州醫(yī)院2013年1～5月期間就診的患者，診斷均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1987年修訂的RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，其中男性17例，女性23例，患者年齡37～80歲，平均年齡57．8±11．0歲。詳細(xì)收集患者的臨床資料，包括癥狀、體征及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等。40例健康對(duì)照者均來自浙江省臺(tái)州醫(yī)院體檢中心的健康體檢者，其中男性15例，女性25例，年齡27～79歲，平均年齡51．8±10．9歲。RA患者組與健康對(duì)照組年齡及性別均無差異。該臨床資料獲取所遵循程序符合負(fù)責(zé)人體試驗(yàn)委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并取得受試對(duì)象的知情同意。

2．DAS28評(píng)分:DAS28評(píng)分參照 Prevoo等［4］的計(jì)算方法，即:DAS28=0．56×壓痛關(guān)節(jié)數(shù)+0．28×腫脹關(guān)節(jié)數(shù) +0．7×ln(紅細(xì)胞沉降率，ESR)×1．08+0．16。DAS28以 28個(gè)關(guān)節(jié)計(jì)分:包括雙肩、雙肘、雙腕、雙手掌指關(guān)節(jié)、雙手近端指間關(guān)節(jié)、雙膝關(guān)節(jié)。DAS28＞5．1表示高疾病活動(dòng)度，3．2＜DAS28＜5．1表示中疾病活動(dòng)度，2．6＜DAS28＜3．2表示低疾病活動(dòng)度，DAS28＜2．6表示疾病緩解。

3．標(biāo)本采集:分別抽取兩組研究對(duì)象清晨空腹靜脈血2ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+HLA－G+T細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞含量后，將剩余全血離心后分離血漿放－20℃保存。

4．主要試劑和儀器:抗人CD4－異硫氰酸熒光素(FITC)抗體、CD25－別藻青蛋白(APC)抗體、CD3－FITC抗體以及FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，抗人Foxp3－藻紅蛋白(PE)抗體及其同型對(duì)照抗體、Foxp3固定/破膜工作液(Foxp3 Staining Buffer Set)、抗人HLA－G－PE抗體及其同型對(duì)照抗體(美國eBioscience公司);HLA－G5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(捷克共和國BioVendor公司)。

5．ELISA方法檢測血漿sHLA－G表達(dá)水平:具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行。讀取血漿樣本的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

6．流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+HLA－G+T細(xì)胞:標(biāo)本管加入10μl CD3－FITC抗體和5μl HLA－G－PE抗體，對(duì)照管加入10μl CD3－FITC抗體和5μl同型對(duì)照抗體IgG2a －PE后，加入EDTA抗凝血100μl，混勻后室溫避光孵育15min，加溶血素2ml，混勻室溫避光10min，1000r/min離心6min后棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入0．5mlPBS重懸細(xì)胞后立即上機(jī)檢測。

7．流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞:每管加入10μl CD4－FITC抗體和10μl CD25－APC抗體后加入EDTA抗凝血100μl，混勻后室溫避光孵育20min，加溶血素2ml，混勻，室溫避光10min，1000r/min離心6min后棄上清，PBS洗滌1次，加入1ml固定/透膜劑，震蕩混勻，4℃避光孵育50min，透膜劑清洗液洗滌1次，用100μl透膜劑清洗液重懸細(xì)胞后標(biāo)本管加入10μl Foxp3－PE抗體，對(duì)照管加入10μl同型對(duì)照抗體IgG1－PE，震蕩混勻，4℃避光孵育50min，透膜劑清洗液洗滌2次，加入0．5mlPBS重懸細(xì)胞后立即上機(jī)檢測。

8．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)用SPSS 17．0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，檢測結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)或中位數(shù)(M)和四分位數(shù)間距(Q25～Q75)表示。計(jì)量資料組間比較根據(jù)數(shù)據(jù)分布類型分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、非參數(shù)Mann－Whitney U檢驗(yàn)，不同指標(biāo)間的相關(guān)性用Spearman分析。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．RA患者血漿sHLA－G的表達(dá)及其與疾病的相關(guān)性:RA組血漿sHLA－G水平與健康對(duì)照組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［36．41(28．28～80.87)U/ml vs 50．44(38．52 ～ 59．62)U/ml，P ＜0.001，圖1］。將RA患者血漿sHLA－G水平與疾病活動(dòng)度及RA各相關(guān)抗體進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)sHLA－G水平與DAS28評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)(r=－0．514，P=0．0007，圖 2)，而與 RF、ESR、CRP、抗CCP抗體和ANA水平等均無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

圖1 RA組與健康對(duì)照組血漿sHLA－G水平的比較

2．RA患者外周血CD3+HLA－G+T細(xì)胞的表達(dá)分析:RA患者外周血CD3+HLA －G+T細(xì)胞百分比較健康對(duì)照組明顯降低［1．05%(0．44% ～2．15%)vs 2.39%(1．09% ～5．52%)，P ＜0．001，圖 3］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，RA患者外周血CD3+HLAG+T細(xì)胞百分比與患者DAS28評(píng)分顯著負(fù)相關(guān)(r=－0．395，P=0．011，圖 4)，但未發(fā)現(xiàn) RA 患者 CD3+HLA－G+T細(xì)胞百分比與RF、ESR、CRP、抗CCP抗體和ANA水平等存在明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

圖2 RA患者血漿sHLA－G水平與DAS28評(píng)分的相關(guān)性分析

圖3 RA組與健康對(duì)照組外周血CD3+HLA－G+T細(xì)胞百分比的比較

圖4 RA患者外周血CD3+HLA－G+T細(xì)胞百分比與DAS28評(píng)分的相關(guān)性分析

3．RA患者外周血Treg細(xì)胞的表達(dá)及其與HLA－G水平的相關(guān)性:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RA患者外周血Treg細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞)百分比較健康對(duì)照組明顯降低［3．25%(2．31% ～4．75%)vs 4．47%(3．66% ～6．30%)，P ＜0．01，圖 5］。另外，對(duì)RA患者外周血Treg細(xì)胞百分比與sHLA－G水平和CD3+HLA－G+T細(xì)胞百分比進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，Treg細(xì)胞百分比與sHLA－G水平存在明顯相關(guān)性(r=0．407，P=0．009，圖 6)，而 Treg 細(xì)胞百分比與CD3+HLA－G+T細(xì)胞百分比無明顯相關(guān)性(r=0.203，P=0．208)。

圖5 RA組與健康對(duì)照組外周血Treg細(xì)胞百分比的比較

圖6 RA患者sHLA－G水平與Treg細(xì)胞百分比的相關(guān)性分析

討 論

近年研究表明HLA－G分子在母胎免疫、器官移植、腫瘤以及慢性炎癥性疾病的免疫耐受中發(fā)揮重要作用［5～7］。HLA－G是機(jī)體內(nèi)一個(gè)重要的免疫調(diào)節(jié)分子，具有mHLA－G(HLA－G1－G4)和sHLAG(HLA－G5－G7)兩種表達(dá)方式。mHLA－G與sHLA－G分子在功能上有著相似的抑制機(jī)體免疫活性細(xì)胞的生物學(xué)作用，它們主要通過與表達(dá)靶細(xì)胞表面的特異性受體 ILT2、ILT4、KIR2DL4 等結(jié)合［8］，傳遞抑制信號(hào)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的功能，如抑制CD4+T細(xì)胞的增殖和干擾原始CD4+T細(xì)胞對(duì)Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞的分化。誘導(dǎo)活化的CD8+T細(xì)胞和CD8+NK細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞殺傷活性，抑制樹突狀細(xì)胞(DC)等的抗原遞呈作用等［1］。此外，HLA－G還可通過各種途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用。Selmani等［2］體外研究發(fā)現(xiàn)，由人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的HLA－G5可誘導(dǎo)T細(xì)胞分化成CD4+CD25highFoxp3+Treg細(xì)胞。另外，經(jīng)HLA－G誘導(dǎo)的致耐受DC細(xì)胞又能誘導(dǎo)T細(xì)胞分化成CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞。而Treg細(xì)胞可通過細(xì)胞間直接接觸和分泌抑制性細(xì)胞因子(如IL－10、TGF－β)等途徑發(fā)揮其免疫抑制的功能。因此，HLA－G的表達(dá)及其誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg細(xì)胞的潛在作用對(duì)維持機(jī)體免疫自穩(wěn)，防止自身免疫性疾病具有極其重要的作用。故我們探討其在RA中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

事實(shí)上，已有研究報(bào)道，RA患者血清sHLA－G濃度顯著低于對(duì)照組，但血清sHLA－G濃度與RA炎癥活度度指標(biāo)呈正相關(guān)［9］。而 Rizzo等［10］對(duì)早期RA患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)早期RA患者血漿sHLA－G水平亦對(duì)照組顯著降低，且血漿sHLA－G水平與RA的炎癥活動(dòng)度指標(biāo)負(fù)相關(guān)。這些都表明sHLA－G的異常表達(dá)可能與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在本研究中，筆者通過ELISA法檢測，發(fā)現(xiàn)RA患者血漿sHLA－G水平比健康對(duì)照組明顯降低。同時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)RA患者外周血CD3+HLAG+T細(xì)胞百分比也較對(duì)照組明顯降低，說明RA患者外周血中可能不僅存在sHLA－G的表達(dá)降低，還存在mHLA－G的表達(dá)降低，而且可能正是因?yàn)檫@些分子表達(dá)數(shù)量上的缺失，導(dǎo)致了機(jī)體免疫抑制功能的低下，從而使T細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞等各種免疫細(xì)胞異?；罨?xì)胞亞群平衡失控，給RA的發(fā)生發(fā)展創(chuàng)造了條件。

另外，筆者還對(duì)RA患者sHLA－G水平及CD3+HLA－G+T細(xì)胞含量與RA疾病活動(dòng)度DAS28評(píng)分及各臨床指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，RA患者sHLA－G水平和CD3+HLA－G+T細(xì)胞百分比均與患者DAS28評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)，提示疾病活動(dòng)度越高的患者，可能HLA－G分子表達(dá)降低越明顯，從而導(dǎo)致患者病情越嚴(yán)重。另外，HLA－G具有抗炎和免疫抑制的功能，因此這些分子的存在可能會(huì)影響疾病的活動(dòng)性。但是，未發(fā)現(xiàn)RA患者sHLA－G水平及CD3+HLA－G+T細(xì)胞百分比與 RF、ESR、CRP、抗CCP抗體和ANA水平等存在明顯相關(guān)性，可能與樣本數(shù)量不夠等因素有關(guān)，具體的關(guān)系還有待于進(jìn)一步深入研究。

越來越多的研究表明，RA患者體內(nèi)存在Treg細(xì)胞數(shù)量減少和(或)功能降低，提示Treg細(xì)胞的異常與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11］。近年，HLA－G表達(dá)與Treg細(xì)胞之間的關(guān)系受到人們的廣泛關(guān)注，二者之間的相關(guān)性已在腫瘤［6］、器官移植等多種疾病中得到證實(shí)，但關(guān)于HLA－G與Treg細(xì)胞在自身免疫性疾病中的相互關(guān)系尚無研究報(bào)道。筆者的研究發(fā)現(xiàn)RA患者外周血Treg細(xì)胞百分比較對(duì)照組明顯降低，與之前研究結(jié)果一致。同時(shí)，為了更好的分析RA患者外周血Treg細(xì)胞水平與HLA－G表達(dá)之間相關(guān)性，筆者分別對(duì)RA患者Treg細(xì)胞百分比與sHLAG水平和CD3+HLA－G+T細(xì)胞百分比進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，Treg細(xì)胞百分比與sHLA－G水平存在明顯正相關(guān)性，而與CD3+HLA－G+T細(xì)胞百分比可能存在正相關(guān)，但結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明HLA－G與Treg細(xì)胞在RA免疫負(fù)調(diào)節(jié)的作用中具有明顯相關(guān)性。由此，筆者推測HLA－G和Treg細(xì)胞之間可能存在相互誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)的信號(hào)途徑，并對(duì)誘導(dǎo)和維持機(jī)體自身免疫耐受起著重要的協(xié)同作用，而這種協(xié)同作用可能主要表現(xiàn)在sHLA－G與Treg細(xì)胞之間，其中關(guān)于其內(nèi)在的具體機(jī)制和調(diào)節(jié)因素還有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，筆者的研究結(jié)果表明，RA患者血漿sHLA－G水平及外周血T細(xì)胞表達(dá)mHLA－G異常降低，提示RA患者體內(nèi)免疫抑制功能低下，從而導(dǎo)致各種炎癥細(xì)胞逃避死亡，細(xì)胞異?；罨图?xì)胞亞群的平衡失控等，極大促進(jìn)RA的發(fā)生發(fā)展。目前國內(nèi)外尚無HLA－G與Treg細(xì)胞在RA中的相關(guān)性研究，而筆者的研究發(fā)現(xiàn)RA患者sHLA－G水平與Treg細(xì)胞百分比呈顯著正相關(guān)，由此推測HLA－G分子和Treg細(xì)胞之間可能存在相互誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)的信號(hào)途徑，并對(duì)誘導(dǎo)和維持機(jī)體自身免疫耐受起著重要的協(xié)同作用，因此，進(jìn)一步深入研究和闡明其相關(guān)信號(hào)通路及具體機(jī)制有助于理解RA的發(fā)病機(jī)制及為RA免疫干預(yù)策略提供新的靶向。

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