馮振中， 武世伍， 李 楠， 蔡兆根， 呂秀紅， 陳嘉薇

1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科，蚌埠醫(yī)學院病理學教研室，安徽省感染與免疫重點實驗室，蚌埠 233004

2上海交通大學附屬上海市第一人民醫(yī)院病理科，上海 200080

環(huán)氧化酶－2（cyclooxygenase－2，COX－2）是催化花生四烯酸轉化為前列腺素物質過程中的限速酶，在胃癌、肝細胞癌、非小細胞性肺癌、乳腺癌、子宮頸癌等多種惡性腫瘤中異常增高［1－4］，其過度表達與腫瘤細胞生長增殖、新生血管形成、侵襲轉移等惡性生物學行為密切相關［5］。COX－2是一種重要的原癌基因，COX－2抑制劑能夠成為腫瘤治療的有效藥物。過氧化物酶體增殖物激活受體－γ（peroxisome proliferator－activated receptor－γ，PPAR－γ ）是核激素受體超家族成員之一，屬于配體依賴的核轉錄因子。近年來的研究發(fā)現，PPAR－γ具有多重生物學效應［6］，參與了細胞增殖、凋亡和分化過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切，而PPAR－γ配體具有明顯的抗腫瘤作用，已成為新的腫瘤治療靶點［7－9］。

迄今為止，COX－2和PPAR－γ在子宮內膜癌中的表達與臨床意義少見相關報道。本研究采用免疫組化方法，結合組織芯片技術，檢測124例子宮內膜樣腺癌和35例正常子宮內膜組織中COX－2、PPAR－γ的表達，分析其相關性；并以2種基因為共同靶點進行藥物干預，使用COX－2選擇性抑制劑塞來昔布和PPAR－γ合成配體羅格列酮，聯合處理子宮內膜癌細胞，觀察對腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移等行為的影響，以期為臨床子宮內膜癌的預防和治療提供新的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1．1 臨床病例及資料

標本取自上海交通大學附屬上海市第一人民醫(yī)院病理科2005年1月至2009年9月手術切除的子宮內膜癌，所有標本均經4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片、蘇木精－伊紅（HE）染色，經病理組織學明確診斷。共124例患者，年齡27～81歲，平均年齡57歲。根據2000年FIGO標準，臨床病理分期為Ⅰ～Ⅱ期101例，Ⅲ～Ⅳ期23例。根據2003年WHO標準，病理分級為高分化57例，中分化41例，低分化26例。肌層浸潤＞50%者40例，≤50%者84例。有淋巴結轉移者31例，無轉移者93例。所有患者術前均未接受放療、化療，具有完整臨床資料，所有腫瘤標本均為子宮內膜樣腺癌。正常子宮內膜35例（增生期16例，分泌期19例），分別取自婦科活檢和子宮平滑肌瘤等良性病變的內膜組織。

1．2 實驗試劑

兔抗人多克隆COX－2抗體（Abcam公司，工作濃度1∶200），兔抗人單克隆PPAR－γ抗體（Cell Signaling公司，工作濃度1∶120），Ultra－Sensitive試劑盒和DAB顯色液（福州邁新公司）。塞來昔布（Celecoxib）購自Sigma公司，羅格列酮（Rosiglitazone）購自Cayman公司，CCK－8試劑盒購自碧云天生物公司，Transwell小室購自Corning公司，細胞培養(yǎng)液及胎牛血清均購自Gibco公司。

1．3 構建組織芯片

選擇所需病例存檔蠟塊，根據HE切片仔細進行形態(tài)學觀察，確定具有代表性的病變部位并標記，由上海芯超生物有限公司技術支持。

1．4 免疫組化染色及結果判定

采用SP兩步免疫組化染色法，實驗步驟嚴格按照說明書進行。PBS代替一抗為陰性對照，已知陽性切片為陽性對照。由2位經驗豐富的病理科醫(yī)生采用雙盲法觀察切片。PPAR－γ蛋白主要定位于細胞核，部分伴有胞質著色，COX－2蛋白定位于細胞質，以子宮內膜腺上皮細胞內出現定位明確、染色明顯的樣本為陽性，根據相關文獻［10－11］，采用半定量積分法判斷結果，根據染色范圍和染色強度評分。將陽性細胞數＜6%，6%～，26%～，51%～，＞75%分別計為0、1、2、3、4分。細胞無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。依兩評分的乘積對染色結果進行評判：＜2分為陰性（－），2～4分為弱陽性（＋），5～8分為陽性（?），9～12分為強陽性（?），若2位專家評定結果相差3分則重新判定。

1．5 腫瘤細胞株及常規(guī)細胞培養(yǎng)

人子宮內膜癌細胞株RL95－2具有較高含量COX－2和基礎量的PPAR－γ［12］，符合本課題實驗需要。該細胞株由上海交通大學附屬上海市第一人民醫(yī)院婦產科研究所保存、惠贈。細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液內，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，至70%～80%融合時，吸去培養(yǎng)液，PBS漂洗，加入胰蛋白酶常溫下消化3min，顯微鏡下觀察細胞分散脫落，加入培養(yǎng)液終止消化，按1∶3傳代培養(yǎng)，常規(guī)取第4代腫瘤細胞用于實驗。

1．6 細胞學實驗分組

無菌條件超凈工作臺環(huán)境下，取適量塞來昔布和羅格列酮，用DMSO使其溶解，配制成10．0 mmol／L的儲備液。再次紫外線無菌處理，分裝，－20℃保存?zhèn)溆?。臨用前配制成實驗所需濃度，所有實驗中DMSO終濃度＜0．1%。

首先，分別使用不同濃度的塞來昔布（0、10、20、30、40、50μmol／L）和羅格列酮（0、5、10、20、30、40 μmol／L）處理RL95－2腫瘤細胞，篩選2種藥物對于腫瘤細胞的合適作用濃度和時間點，為聯合應用塞來昔布和羅格列酮尋找適宜實驗條件。根據預實驗結果，選擇塞來昔布30μmol／L和羅格列酮20 μmol／L作為進一步聯合應用時的藥物濃度。依下列分組處理細胞：空白對照組、塞來昔布（30μmol／L）組、羅格列酮（20μmol／L）組、聯合用藥組。

1．7 CCK－8檢測

取對數生長期腫瘤細胞，調整細胞密度為5×104／mL，加于96孔培養(yǎng)板，每孔100mL，設5個復孔，孵育12h后，各組更換含單獨和聯合藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72h時取1塊細胞培養(yǎng)板，小心吸去原培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍，每孔分別加入200μL新鮮培養(yǎng)液及15μL CCK－8試劑，繼續(xù)孵育1．5 h，酶標儀測定在450nm處的吸光度（A）值，按公式：細胞抑制率（%）＝（1－實驗孔A值／對照孔A值）×100%，計算出RL95－2腫瘤細胞的增殖抑制率，得出劑量反應曲線。以上實驗重復3次。

1．8 平板克隆形成實驗

取狀態(tài)良好的對數生長期RL95－2腫瘤細胞，細胞計數儀計數，稀釋至細胞密度為1 000個／mL。取500μL的單細胞懸液加入35mm直徑細胞培養(yǎng)皿中，孵育12h。按照分組加入相應藥物，處理48 h。撤除含有藥物的培養(yǎng)液，加入常規(guī)細胞培養(yǎng)液，7d后開始持續(xù)觀察形成的細胞集落情況，持續(xù)至12d，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2遍，冰冷的甲醇－20℃固定30min，吉姆薩染液染色10min，洗去染液，常溫晾干。計數標準：細胞集落直徑大于1mm記為陽性。數碼相機拍照。以上實驗重復3次。

1．9 細胞侵襲實驗

將Matrigel Matrix原液置于冰上，于4℃冰箱保存過夜，使其融化，用預冷的槍頭混勻，和無血清培養(yǎng)液DMEM按1∶3稀釋，每孔加50μL，放于細胞培養(yǎng)箱中風干過夜。實驗時每孔加入適量無血清DMEM培養(yǎng)液，以水化基質膠，放置60min，取生長狀態(tài)良好的對數生長期RL95－2腫瘤細胞，調整細胞數至2×105／mL，取細胞懸液200μL（細胞數4×104）加入Transwell上層小室，分別加入各組藥物處理48h，下層小室加入500μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)液。取出小室，4%甲醛固定20min，蘇木精染色10min，PBS漂洗1min。在倒置顯微鏡下計數細胞并拍照，每個樣本計數5個高倍視野，取其均值。以上實驗重復3次。

1．10 細胞遷移實驗

基本步驟同上述侵襲實驗，但省略Transwell小室Matrigel基質膠的制備，即不需要在小室中加入Matrigel膠和水化。細胞懸液200μL（細胞數4×104）加入上層小室，各組藥物干預48h。以上實驗重復3次。

1．11 Western blot實驗

取生長狀態(tài)良好的對數生長期細胞，加入各組藥物處理48h，收集細胞備用。根據抗體說明書和預實驗情況，一抗孵育濃度分別為兔抗人β－actin多克隆抗體1∶2 000，兔抗人COX－2多克隆抗體1∶1 000，兔抗人PPAR－γ單克隆抗體1∶3 000，其他實驗步驟同參考文獻［13］。以上實驗重復3次。

1．12 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件。計數資料率的比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率法檢驗，相關關系采用Spearman等級相關分析，計量資料以±s表示，單因素方差分析（one－way ANOVA）比較各實驗組均數間的差異，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 COX－2和PPAR－γ蛋白在子宮內膜組織中的表達及其相關性

COX－2蛋白在子宮內膜樣腺癌中的表達率為66．9%（83／124），明顯高于正常內膜組織的5．7%（2／35，P＜0．01）。PPAR－γ蛋白的表達呈相反趨勢，在子宮內膜樣腺癌和正常子宮內膜組織中的陽性率分別為：39．5%（49／124）、62．9%（22／35）（P＜0．05）。見圖1。

圖1 COX－2、PPAR－γ在子宮內膜組織中的表達（SP法；A、C、E×40，B、D、F×200）Fig．1 Expression of COX－2and PPAR－γin different endometrial tissues（SP method；A，C，E ×40；B，D，F ×200）

41例COX－2陰性的腫瘤組織中，有21例（51．2%，21／41）PPAR－γ陽性表達，而83例 COX－2陽性標本，僅有28例（34．6%，28／83）PPAR－γ陽性表達，Spearman相關分析發(fā)現兩者呈負相關（rs＝－0．192，P＜0．05）。

2．2 COX－2和PPAR－γ表達與子宮內膜樣腺癌臨床病理因素的關系

子宮內膜樣腺癌中COX－2的表達在低分化腫瘤細胞、腫瘤臨床晚期、淋巴結轉移患者中明顯升高（P＜0．05）。PPAR－γ蛋白與病理分級負性相關（P＜0．05）。見表1。

2．3 塞來昔布和羅格列酮聯合應用抑制RL95－2腫瘤細胞的增殖

CCK－8比色實驗結果表明：塞來昔布30μmol／L和羅格列酮20μmol／L處理RL95－2子宮內膜癌細胞后，能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖（P＜0．05），與藥物單獨干預比較，聯合應用產生的抑制效應更加顯著（P＜0．01）（圖2）。

表1 COX－2和PPAR－γ蛋白表達與子宮內膜樣腺癌臨床病理因素的關系Table 1 Association of COX－2and PPAR－γprotein expression with clinicopathological parameters in endometrial carcinoma

2．4 塞來昔布和羅格列酮聯合應用抑制RL95－2腫瘤細胞克隆團形成

圖2 塞來昔布和羅格列酮聯合應用抑制RL95－2子宮內膜癌細胞增殖的作用Fig．2 Effects of Celecoxib combined with Rosiglitazone on proliferation of RL95－2endometrial carcinoma

細胞集落形成實驗是反映細胞增殖和獨立生長能力的良好指標，本實驗采用平板克隆形成實驗，觀察塞來昔布和羅格列酮聯合應用對于RL95－2細胞的影響。結果顯示，對照組腫瘤細胞形成的克隆團數目為135．33，30μmol／L塞來昔布和20μmol／L羅格列酮分別及聯合干預48h后，陽性克隆團數目分別為52．67、62．00、21．33，與對照組比較，用藥組能夠抑制RL95－2細胞克隆團形成（P＜0．05），與單獨干預比較，聯合應用產生的抑制效應更加顯著（P＜0．01）（圖3）。

2．5 塞來昔布和羅格列酮聯合應用抑制RL95－2腫瘤細胞的侵襲能力

塞來昔布和羅格列酮處理RL95－2腫瘤細胞48 h，與對照組比較，腫瘤細胞穿越Matrigel基底膜的數量明顯減少（P＜0．05），與單獨藥物比較，聯合處理后侵襲細胞的數量更少（P＜0．01）（圖4）。

2．6 塞來昔布和羅格列酮聯合應用抑制RL95－2腫瘤細胞的遷移能力

塞來昔布和羅格列酮處理RL95－2腫瘤細胞48 h，與對照組比較，腫瘤細胞穿越濾膜的數量均明顯減少（均P＜0．05），與單獨藥物比較，聯合處理后遷移細胞的數量更少（圖5）。

圖3 塞來昔布和羅格列酮聯合應用抑制RL95－2細胞克隆團的形成Fig．3 Inhibitory effect of Celecoxib combined with Rosiglitazone on colony formation of RL95－2cells

圖4 塞來昔布和羅格列酮抑制RL95－2細胞侵襲能力Fig．4 Inhibitory effects of Celecoxib and Rosiglitazone on the invasion ability of RL95－2cells

圖5 塞來昔布和羅格列酮抑制RL95－2細胞遷移能力Fig．5 Inhibitory effects of Celecoxib and Rosiglitazone on the migration ability of RL95－2cells

2．7 塞來昔布和羅格列酮聯合應用對COX－2、PPAR－γ蛋白表達的影響

塞來昔布和羅格列酮作用于RL95－2子宮內膜癌細胞48h后，Western blot檢測顯示，COX－2蛋白條帶減弱，與內參組β－actin吸光度值之比，對照組、塞來昔布組、羅格列酮組、聯合藥物組分別為0．757、0．395、0．421、0．226；PPAR－γ的條帶表達增粗，與內參組β－actin吸光度值之比，各組分別為0．683、0．959、1．132、1．461。吸光度掃描半定量測定發(fā)現，用藥組能夠下調COX－2蛋白表達，上調PPAR－γ的表達（均P＜0．05），與單獨干預比較，聯合應用產生的調節(jié)效應更加顯著（P＜0．05，圖6）。

圖6 塞來昔布和羅格列酮對RL95－2細胞COX－2和PPAR－γ蛋白表達的影響Fig．6 Expression of COX－2and PPAR－γin RL95－2cells treated with Celecoxib and Rosiglitazone

3 討論

子宮內膜癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，約占女性癌癥總數的7%，占女性生殖道惡性腫瘤的30%，嚴重威脅女性健康［14］。近年來，子宮內膜癌的發(fā)病率和致死率呈逐漸上升趨勢，而且年輕患者的比例逐漸升高，40歲以下的育齡期子宮內膜癌患者約占8%～14%，其中多數為未生育者［15］。對子宮內膜癌進行保守治療引起了廣泛的關注，目前傳統(tǒng)的保守療法是孕激素治療，但是約25%左右的患者不敏感，長期服用也會出現激素耐藥性和較高的復發(fā)率，并容易產生各種副反應［16－17］。探索新的藥物作用靶點和療效明顯、副反應較小的有效藥物，將對子宮內膜癌的預防和臨床治療產生積極作用，已成為婦科腫瘤研究領域的新熱點。

迄今為止，關于COX－2和PPAR－γ在腫瘤中相互關系的研究報道較少，調控機制尚不十分明確。Badawi等［18］收集乳腺正常組織和良性病變、原位癌、浸潤癌和淋巴結轉移標本，定量PCR檢測發(fā)現COX－2mRNA水平隨著乳腺惡性轉變過程而逐漸遞增，PPAR－γmRNA的表達則逐漸遞減，兩者呈負性相關。本研究發(fā)現，COX－2的表達從正常內膜組織到子宮內膜癌的演變過程中不斷遞增，在低分化腫瘤細胞、臨床晚期、淋巴結轉移患者中，陽性表達率明顯增加，而PPAR－γ蛋白的表達在子宮內膜癌變過程中逐漸減少，在高分化腫瘤細胞中陽性表達明顯，與COX－2的表達呈相反趨勢，二者在子宮內膜樣腺癌中呈負相關（rs＝－0．192，P＜0．05）。結果提示，COX－2蛋白表達明顯升高，PPAR－γ蛋白表達相對降低，兩者可能共同參與了子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

由于COX－2本身并不具有信號傳導激酶的作用，其在腫瘤細胞中的信號傳導途徑是通過催化下游的各種前列腺素產物，結合相應的受體來完成調節(jié)功能。PPAR－γ具有結合內源性前列腺素特性，所以PPAR－γ可能是COX－2基因重要的下游調控靶點，而PPAR－γ也可通過反饋機制影響COX－2的表達，其配體可以抑制前列腺素的合成和功能，發(fā)揮抑制腫瘤作用，說明COX－2和PPAR－γ之間存在復雜的網絡調控機制［19］。Wick等［20］報道非甾體類抗炎藥（NSAIDs）舒林酸能夠有效抑制肺非小細胞肺癌的增殖和荷瘤小鼠的腫瘤生長，熒光素酶報告基因檢測發(fā)現舒林酸和環(huán)格列酮（一種PPAR－γ配體）都可以明顯促進PPAR－γ反應元件的表達，而對于不表達COX－2的肺非小細胞肺癌，舒林酸和環(huán)格列酮也可以抑制腫瘤細胞的增殖，說明NSAIDS存在著不依賴COX－2的腫瘤抑制途徑，而PPAR－γ可能是NSAIDS的直接效應靶點，在抑瘤過程中發(fā)揮作用。本實驗結果發(fā)現，塞來昔布和羅格列酮分別處理RL95－2腫瘤細胞48h后，兩者均上調了PPAR－γ的表達 （P＜0．05），同時COX－2蛋白表達明顯降低（P＜0．05），提示塞來昔布和羅格列酮的直接作用靶點包括COX－2和PPAR－γ兩種基因。

目前，聯合應用COX－2抑制劑和PPAR－γ配體對腫瘤進行干預的研究報道少見。Sun等［21］使用COX－2選擇性抑制劑NS－398和羅格列酮共同處理人胰腺癌細胞株SW1990，發(fā)現2種藥物明顯降低腫瘤細胞的生長速度和增殖能力，用藥聯合指數在12、24、48h分別為0．89、0．74、0．70，提示 NS－398和羅格列酮的共同使用產生了協(xié)同抑瘤作用。本研究通過CCK－8比色實驗和細胞集落形成實驗發(fā)現，COX－2選擇性抑制劑塞來昔布和PPAR－γ配體羅格列酮能夠有效抑制RL95－2子宮內膜癌細胞的增殖能力，通過Transwell小室實驗發(fā)現，2種藥物可以降低腫瘤的侵襲、轉移能力，聯合應用時的抑瘤效果明顯高于單獨藥物組，Western blot檢測結果發(fā)現，兩種藥物可以明顯降低COX－2蛋白的表達，增加PPAR－γ蛋白的表達。

結合以上研究可以合理推測，COX－2和PPAR－γ參與子宮內膜樣腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，使用COX－2選擇性抑制劑和PPAR－γ配體聯合干預腫瘤，可能成為拮抗子宮內膜癌的重要手段和新的有效途徑，為臨床腫瘤的預防和治療提供新的思路和理論依據。

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