李 淼，曾柏全，馮金儒

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410004）

高產(chǎn)纖維素酶菌株原生質(zhì)體制備及再生條件

李 淼，曾柏全，馮金儒

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410004）

研究青霉菌Penicillium Q5和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis K3原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件。采用酶解法制備了青霉菌和枯草芽孢桿菌的高質(zhì)量的原生質(zhì)體。試驗(yàn)對(duì)親本菌株的菌絲生長，酶濃度，酶解時(shí)間和滅活時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。親本菌株Q5，培養(yǎng)液中加入濃度0.5%甘氨酸和含量10%的蔗糖處理后，在質(zhì)量濃度均為10 mg/mL的溶菌酶和蝸牛酶(1︰1)酶解作用下，35℃處理3 h，原生質(zhì)體生成量達(dá)到最大值，為7.35×106cfu/mL；親本菌株K3，用4 U/mL的青霉素處理，在1 mg/mL的溶菌酶作用下，35 ℃處理1 h，原生質(zhì)體形成率與再生率的乘積達(dá)到最大值，此時(shí)K3原生質(zhì)體量為1.46×107cfu/mL。青霉菌在65 ℃熱滅活的時(shí)間為1 h，紫外滅活時(shí)間為3 min；枯草芽孢桿菌在65℃熱滅活的時(shí)間是2.5 h，紫外滅活時(shí)間為5 min。這為后續(xù)原生質(zhì)體融合選育具有抗逆性的高產(chǎn)纖維素酶菌株打下基礎(chǔ)。

青霉菌Q5；枯草芽孢桿菌K3；原生質(zhì)體制備；原生質(zhì)體再生；原生質(zhì)體滅活

纖維素(cellulose)被稱為是地球上分布最廣泛，含量最豐富、最廉價(jià)的可再生資源，其降解需要纖維素酶(cellulase)，纖維素酶具有廣泛的工業(yè)用途[1-3]，可能成為需求量最大的工業(yè)用酶[4]，目前關(guān)于纖維素酶方面的研究很多，但主要瓶頸性的問題在于目前用于纖維素酶的生產(chǎn)菌如里氏木酶 (T.reesei) 等，酶活力都比較低[5-6]，對(duì)酸堿及溫度的適應(yīng)性不強(qiáng)。因此，選育出產(chǎn)纖維素酶量多、活力高及抗逆性較強(qiáng)的菌株對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的意義。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是好氧或兼性厭氧型的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，廣泛分布在自然界，其產(chǎn)生的芽孢具有耐熱、耐酸堿、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑等強(qiáng)抗逆性。在工業(yè)生產(chǎn)高溫干燥的環(huán)境中，該特性可以保證微生物菌劑的活性，提高產(chǎn)品質(zhì)量[7]。

原生質(zhì)體融通過酶解去除親本的細(xì)胞壁，進(jìn)行融合，經(jīng)過基因重組，獲得具有雙親優(yōu)良性狀的融合子，具有廣泛的應(yīng)用性和隨機(jī)性[8-9]。該技術(shù)自20世紀(jì)70年代發(fā)展至今，已得到廣泛應(yīng)用，Xu 等[10]以 4 株普納霉素高產(chǎn)量的始旋鏈霉菌(S.pristinaespiralis) CGMCC0957突變菌為親本進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到的優(yōu)良菌株，普納霉素產(chǎn)量比親本高89.4%。Jin等[11]以10株產(chǎn)量較高的多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora spinosa為出發(fā)菌株，經(jīng)過融合，得到高產(chǎn)菌株S. spinosa 4-7，其產(chǎn)量可達(dá)到547 mg/L，較出發(fā)菌株提高了200.55%以上。

本課題以產(chǎn)纖維素酶的青霉Q5和具有抗逆性的枯草芽孢桿菌K3為親本，采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，PEG誘導(dǎo)雙親滅活原生質(zhì)體融合，從得到的融合子中篩選保留雙親菌株優(yōu)良性狀的新菌株，即獲得高產(chǎn)纖維素酶活力及抗逆性較強(qiáng)的新菌株。實(shí)驗(yàn)中就原生質(zhì)體制備和融合過程中的幾個(gè)影響因子進(jìn)行了研究和優(yōu)化，以期達(dá)到較高的形成率、再生率和融合率，為更好地獲得融合子提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

菌種：青霉菌，枯草芽孢桿菌；均保存于中南林業(yè)科技大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基；LB培養(yǎng)基；

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨0.4 g，酵母浸出膏0.05 g，藥媒 3.18 g，淀粉 3 g，(NH4)2SO40.2 g，KH2PO40.4 g，CaCl20.03 g，MgSO40.03 g，CMCNa 3 g，水 100 mL，121 ℃高壓滅菌 20 min；

菌絲培養(yǎng)液：蛋白胨 0.5 g，葡萄糖 1.0 g，酵母膏 0.4 g，MgSO40.05 g，KH2PO40.2 g，K2HPO40.4 g，水 100 mL，pH 5.8。

高滲再生培養(yǎng)基：蔗糖120 g，葡萄糖20 g，MgSO40.2 g，(NH4)2SO42.8 g， 尿 素 0.6 g， 硫酸 鉀 4 g，F(xiàn)eSO40.01 g，MnSO40.003 g，ZnSO40.002 g，CaCl20.6 g，補(bǔ)水至 1 L，121 ℃高壓滅菌 20 min。

篩選培養(yǎng)基：(NH4)2SO42.0 g，MgSO40.5 g，KH2PO41 g，NaCl 0.5 g，CMC-Na 20 g，剛果紅0.4 g，瓊脂 20 g，水 1 L，調(diào)節(jié) pH 為 3 ～ 11，121 ℃高壓滅菌 20 min。

1.1.3 主要試劑

原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM)：0.5 mol/L蔗糖，0.02 mol/L MgC12，0.02 mol/L CaCl2，0.02 mol/L順丁烯二酸，pH6.0；

高滲磷酸緩沖液(P液)：0.2 mol/L磷酸緩沖液 pH6.0，0.7 mol/L 甘露醇；

高 Ca2+和高 pH 值液：0.05 mol/L CaCl2，0.6 mol/L甘露醇，pH值10.5；

溶菌酶和蝸牛酶溶解于穩(wěn)定液中，過濾除菌后備用；

PEG- 6000 溶液。

1.1.4 主要儀器

SW-CJ-1F 型水平超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司）、PYX-280S-A型生化培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）、UV-1700紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）、全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器（DAΙHANLABTECH Co.,LTD）、倒置相差顯微鏡（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Benkman Coulter,Ιnc.）、AL204 型電子天平（ 梅特勒-托利多儀器有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青霉菌 Q5 原生質(zhì)體制備

參照Aldo的方法[12]。將活化后的菌液轉(zhuǎn)接入含有甘氨酸和蔗糖的菌絲培養(yǎng)液中，培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，用無菌濾紙吸干水分，然后加入質(zhì)量濃度均為10 mg/mL溶菌酶和蝸牛酶混合酶液中，35 ℃水浴中酶解，每隔0.5 h取樣，觀察原生質(zhì)體形成情況。酶解結(jié)束用4層無菌擦鏡紙過濾未酶解的菌絲，離心收集原生質(zhì)體，將其懸浮于SMM溶液中。

1.2.2 枯草芽孢桿菌 K3 原生質(zhì)體制備

參照李麗的方法[13]。取活化后的菌液37℃振蕩培養(yǎng) 3 h，使細(xì)胞生長進(jìn)入對(duì)數(shù)前期，加入適量青霉素，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后離心收集菌體，將菌體懸浮 SMM 中。取 0.5 mL 菌懸液，加入 0.5 mL 溶菌酶溶液，混勻后于37℃水浴保溫處理，每隔15 min取樣鏡檢，酶解結(jié)束離心收集原生質(zhì)體，將其懸浮于SMM溶液中。

1.2.3 原生質(zhì)體形成率、再生率及滅活率的計(jì)算

無菌水稀釋原生質(zhì)體懸液，靜置10 min，使原生質(zhì)體裂解死亡，再梯度稀釋涂布于高滲再生培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)算原生質(zhì)體形成率。SMM溶液梯度稀釋原生質(zhì)體懸液，涂布在高滲再生培養(yǎng)基的平板上，計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算原生質(zhì)體再生率。

式（1）中：A為酶處理前完全培養(yǎng)基上菌落數(shù)；B為酶處理后再經(jīng)低滲處理獲得的菌落數(shù)。

式（2）中：α為酶處理前完全培養(yǎng)基上菌落數(shù)；β為酶處理后再經(jīng)低滲處理獲得的菌落數(shù)；γ為酶處理后再經(jīng)高滲處理獲得的菌落數(shù)。

將兩親本原生質(zhì)體懸液，于65 ℃恒溫水浴箱中保溫滅活，以未被高溫處理的原生質(zhì)體對(duì)照。將原生質(zhì)體懸液置于30 W紫外燈20 cm處紫外照射滅活。以未經(jīng)紫外線滅活的原生質(zhì)體懸液為對(duì)照，32 ℃培養(yǎng)3～5 d。以處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，滅活率為縱坐標(biāo)繪制滅活曲線。

式（3）中：δ為未被處理菌體長出的菌落數(shù)；θ為被處理菌體長出的菌落數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 親本菌株的培養(yǎng)

2.1.1 蔗糖對(duì) Q5 菌絲生長的影響

將活化后的Q5菌絲，轉(zhuǎn)接到蔗糖質(zhì)量濃度分別為0、10、15、20%的菌絲培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用定量濾紙過濾，烘干至恒重，稱量得菌絲干重。

在Q5菌絲的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液中添加蔗糖，蔗糖，既作為碳源提供能量，可促進(jìn)菌絲快速生長，還調(diào)節(jié)了細(xì)胞的滲透壓[14]，并可保持菌絲在培養(yǎng)基中的分散狀態(tài)。如圖1所示，當(dāng)蔗糖為10%時(shí)，菌絲體的量達(dá)到最大值，但隨著蔗糖濃度的逐漸增大，代謝產(chǎn)物中有機(jī)酸積累，抑制了菌絲體的生長，開始產(chǎn)生孢子，且菌絲團(tuán)結(jié)球緊密，游離菌絲減少，與酶液接觸受限，不利于原生質(zhì)體的形成。

2.1.2 甘氨酸對(duì)親本菌株生長的影響

圖2中顯示，Gly濃度在0%～1.0 %范圍之內(nèi)，Q5菌絲生長量遞減緩慢，之后隨其濃度的增加，生長量急劇減少。而K3菌在添加了甘氨酸的培養(yǎng)液中生長3 h后，菌體生長受到抑制。這可能是因?yàn)镚ly可代替細(xì)胞壁肽聚糖中D2丙氨酸，從而影響了細(xì)胞壁短肽鏈之間的聯(lián)結(jié)，造成細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏散，抑制了細(xì)胞的生長[15]。培養(yǎng)液中添加Gly可使細(xì)胞壁易被溶菌酶降解，易于原生質(zhì)體的形成，但是Gly濃度過大，會(huì)影響菌體的生長，使形成率下降，且容易造成酶解過度而影響原生質(zhì)體的再生。因此，Q5選用質(zhì)量濃度為0.5%～1.0%的Gly為宜。而K3培養(yǎng)過程甘氨酸的添加量≤0.5%。

圖1 蔗糖濃度對(duì)青霉菌Q5菌絲生長的影響Fig. 1 Effect of sucrose concentration on mycelial growth of Penicillium Q5

圖2 甘氨酸濃度對(duì)親本菌株生長的影響Fig 2 Effects of Gly concentration on growth of parent strains

2.1.3 青霉素對(duì) K3 原生質(zhì)體形成的影響

當(dāng)細(xì)菌生長至對(duì)數(shù)前期，加入25 u/mL 青霉素，使其終濃度分別為0，1，2，3，4，5 u/mL，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2 h測OD600值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)兩次。

由圖3可知，隨著時(shí)間的推移和青霉素濃度的增大，K3菌受青霉素的影響增強(qiáng)。由于青霉素可以干擾細(xì)胞壁上肽聚糖的合成，進(jìn)而影響細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性和空間結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，易于被溶菌酶溶解[16]。圖中顯示青霉素濃度在5 U/mL時(shí)，K3的生長受到嚴(yán)重抑制，故在實(shí)驗(yàn)過程中采用亞抑制劑量4 U/mL的青霉素。

圖3 青霉素濃度對(duì)枯草芽孢桿菌K3的影響 Fig 3 Effects of penicillin concentration on growth of Bacillus subtilis K3

2.2 原生質(zhì)體的制備與再生

2.2.1 酶液濃度對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響

收集培養(yǎng)好的Q5菌絲用質(zhì)量濃度均為10 mg/mL溶菌酶和蝸牛酶以不同比例混合酶解2 h，K3菌經(jīng)處理后，以不同濃度的溶菌酶酶解1 h，之后涂于等滲再生培養(yǎng)基上，檢測原生質(zhì)體的形成和再生。

由于青霉細(xì)胞壁成分復(fù)雜，要獲得較高的原生質(zhì)體生成量，要合適的裂解酶。表1的數(shù)據(jù)顯示，使用混合酶比單一酶酶解效果好。在顯微鏡觀察下，經(jīng)溶菌酶處理的菌絲大量斷裂，但形成的原生質(zhì)體較少。這可能是由于溶菌酶主要作用于細(xì)胞壁粘肽結(jié)構(gòu)中的β-1,4糖苷鍵，而青霉細(xì)胞壁的組成成分復(fù)雜，溶菌酶對(duì)其菌絲去壁的作用不明顯。實(shí)驗(yàn)中以溶菌酶和蝸牛酶1︰1的比例處理為宜。

表1 酶解濃度對(duì)親本菌株原生質(zhì)體的形成和再生的影響Table 1 Effects of enzyme concentration on protoplsat formation and regeneration of parent strains

K3原生質(zhì)體的形成率隨著溶菌酶液濃度的增加而增大。但其再生率在1 mg/mL達(dá)到最大值后，在酶液濃度為2 mg/mL時(shí)開始出現(xiàn)下降趨勢，可能是由于溶菌酶的質(zhì)量濃度增大，枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁被破壞的較徹底，其修復(fù)和再生的能力變?nèi)?，影響其在再生培養(yǎng)基上的再生。故而選擇1 mg/mL的溶菌酶酶解枯草芽孢桿菌為宜。

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)菌株原生質(zhì)體形成和再生的影響

取處理好的菌液，收集菌體。青霉Q5以質(zhì)量濃度均為10 mg/mL溶菌酶和蝸牛酶1∶1混合液酶解；K3菌以1 mg/mL溶菌酶溶液酶解，置于35 ℃水浴保溫處理，每隔一段時(shí)間鏡檢計(jì)數(shù)，計(jì)算兩菌株原生質(zhì)體的生成量和再生率，繪制成圖4。

圖4中顯示青霉在3 h時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最大值，7.35×106cfu/mL，再生率為37.81%，此時(shí)原生質(zhì)體活力最好。在4 h時(shí)，其形成率開始下降，這可能是由于隨著酶液在細(xì)胞壁上作用時(shí)間的延長，裂解酶進(jìn)一步損傷原生質(zhì)體[17]，使其破裂，且再生率也隨之下降。而隨著溶菌酶處理枯草芽孢桿菌的時(shí)間增長，原生質(zhì)體的數(shù)量逐漸增多，原生質(zhì)體形成率在酶解2 h后達(dá)到86.54%，而其再生率在1 h達(dá)到27%后開始下降，原生質(zhì)體的形成率與再生率在其制備過程中同等重要，故選用二者的乘積作為影響因素的考察指標(biāo)[18]。由形成率和再生率的乘積來看，酶解時(shí)間1 h為最適時(shí)間。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)菌株原生質(zhì)體形成和再生率的影響Fig.4 Effects of enzyme treatment time on protoplast formation and regeneration of parent strains

2.2.3 青霉原生質(zhì)體形成過程

青霉Q5菌絲在酶液的作用下，隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體由菌絲頂端和段端位釋放[19]，前期形成的原生質(zhì)體較小，到酶解中期，大部分菌絲被酶解為片段，可以看到大量菌絲頂端與段端位膨大，釋放出更多原生質(zhì)體，視野內(nèi)出現(xiàn)大量不規(guī)則細(xì)胞，可能是由于此時(shí)釋放的原生質(zhì)體還帶有破碎的菌絲細(xì)胞壁，在酶解后期，原生質(zhì)體在適合的滲透壓下維持圓形。

2.2.4 枯草芽孢桿菌 K3 原生質(zhì)體形成過程

K3菌體在溶菌酶的作用下，隨著酶解時(shí)間的增長，由菌體一端釋放原生質(zhì)體，到酶解中期時(shí)(圖6B)，視野中出現(xiàn)大量頂端帶有球形的桿菌，到酶解后期，視野中出現(xiàn)大量圓形原生質(zhì)體(圖6C)。

圖5 青霉菌的原生質(zhì)體的制備（60× 油鏡）Fig. 5 Protoplast preparation of Penicillium Q5 (photographed by 60×oil immersion lens)

圖6 枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備（60×油鏡）Fig. 6 Protoplast preparation of Bacillus subtilis K3 (photographed by 60×oil immersion lens)

2.3 滅活條件的確定

2.3.1 熱滅活時(shí)間的確定

高溫處理對(duì)親本原生質(zhì)體細(xì)胞進(jìn)行鈍化處理，使細(xì)胞內(nèi)某些遺傳物質(zhì)不能正常表達(dá)，進(jìn)而無法長出正常細(xì)胞，當(dāng)兩親本融合后，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)可能因互補(bǔ)而長出菌落。由圖7看出，Q5原生質(zhì)體在65 ℃水浴處理1 h后，滅活率已基本趨于100%，而K3原生質(zhì)體65 ℃熱滅活的最適時(shí)間是2.5 h。

2.3.2 紫外滅活時(shí)間的確定

以紫外線處理原生質(zhì)體，影響了細(xì)胞內(nèi)某些功能的喪失，而融合子可能由于細(xì)胞間的重組修復(fù)了這種損傷，進(jìn)而可以在平板上長出菌落。由圖8看出，Q5的最適滅活時(shí)間是3 min，K3的最適熱滅活時(shí)間是5 min。

圖7 溫度處理對(duì)青霉菌Q5和枯草芽孢桿菌的影響K3Fig.7 Effects of temperature treatment on livability of Penicillium Q5 and Bacillus subtilis K3

圖8 青霉菌Q5和枯草芽孢桿菌K3紫外滅活曲線Fig. 8 Ultraviolet inactivation curves of Penicillium Q5 and Bacillus subtilis K3

3 結(jié) 論

筆者采用酶解法獲得青霉菌和枯草芽孢桿菌的高質(zhì)量的原生質(zhì)體，酶解前在Q5菌絲培養(yǎng)液中加入質(zhì)量濃度0.5%甘氨酸和質(zhì)量濃度10%的蔗糖，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，菌絲分散，有利于酶解，但甘氨酸和蔗糖濃度過高時(shí)，會(huì)因酶解過度進(jìn)而影響原生質(zhì)體的再生率。在K3的培養(yǎng)液中加入低濃度的青霉素(4 U/mL)和甘氨酸(0.5%)，兩者均可干擾桿菌細(xì)胞壁的合成，提高原生質(zhì)體的形成率。增加酶的質(zhì)量濃度，延長酶解時(shí)間均可使原生質(zhì)體的形成率升高，但是影響了原生質(zhì)體的再生，這可能是由于在高濃度的酶液和較長時(shí)間的酶解作用下，細(xì)胞壁的成分被很大程度上遭到破壞，在缺乏引物的情況下，細(xì)胞壁的再生會(huì)變得很困難，從而影響原生質(zhì)體的再生率[20]。因此試驗(yàn)中以質(zhì)量濃度均為10 mg/mL的溶菌酶和蝸牛酶(1∶1)混合后作用于Q5，35 ℃處理3 h，原生質(zhì)體生成量達(dá)到最大值為7.35×106cfu/mL，再生率為37.81%；枯草芽孢桿菌K3在1 mg/mL的溶菌酶作用下，35 ℃處理1 h，其原生質(zhì)體形成率與再生率的乘積達(dá)到最大值，此時(shí)原生質(zhì)體量達(dá)到最大值為1.46×107cfu/mL，再生率為27%。青霉菌在65 ℃熱滅活的時(shí)間為1 h，紫外滅活時(shí)間為3 min；枯草芽孢桿菌在65 ℃熱滅活的時(shí)間是2.5 h，紫外滅活時(shí)間為5 min。用溫度和紫外處理親本原生質(zhì)體，使細(xì)胞某些遺傳物質(zhì)無法表達(dá)或無法正常工作，而使其不能成長為正常的菌落，在融合子中可能會(huì)因?yàn)榧?xì)胞間的重組和互補(bǔ)而得到修復(fù)。

在原生質(zhì)體育種技術(shù)中，原生質(zhì)體的制備是關(guān)鍵性的一環(huán)，在酶解去壁的過程中，各因子對(duì)原生質(zhì)體的形成率和再生率都起著至關(guān)重要的作用，這些影響因子的條件會(huì)因菌株的差異而各不相同。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Q5和K3原生質(zhì)體的制備和再生進(jìn)行了研究，提高了原生質(zhì)體融合的效率，為后續(xù)選育新菌株打下了基礎(chǔ)。

[1]Estácio Jussie Odisi, Marcela Bruschi Silvestrin, Rodrigo Yoji Uwamori Takahashi, et al. Bioprospection of cellulolytic and lipolytic South Atlantic deep-sea bacteria[J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2012, 15∶ 1-11.

[2]劉超綱 . 纖維素酶的工業(yè)應(yīng)用展望 [J]. 經(jīng)濟(jì)林研究 , 1996, 14 (1)∶ 30-31.

[3]陸 晨 , 陳介南 , 王義強(qiáng) , 等 . 一株產(chǎn)纖維素酶真菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化 [J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào) , 2012, 32(6)∶ 118-122.

[4]Wilson D B. Cellulases and biofuels [J]. Curr Opin Biotechnol. 2009, 20 (3)∶295–299.

[5]Soloveva Ι V, Okunev O N, Kryukora E G. Neutral cellulases of mycelial fungi∶searching for producer sand their characterization[J]. Biochem. Microbiology, 1997,33 (4)∶388-392.

[6]杜先林 , 李 輝 , 王義強(qiáng) , 等 . 里氏木霉 Rut-30 產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的優(yōu)化 [J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào) , 2010, 30 (9)∶ 112-119.

[7]Abdul Sattar Qureshi, Muhammad Aqeel Bhutto, Yusuf Chisti, et al. Production of pectinase by Bacillus subtilis EFRL 01 in a date syrup medium[J]. African Journal of Biotechnology, 2012, 11(62)∶12563-12570.

[8]Zheng H J, Gong J X, Chen T, et al. Strain improvement of Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538 for acid tolerance and production of D-lactic acid by genome shuffling[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85∶ 1541-1549.

[9]任柏林, 謝水波, 劉迎久, 等. 單親滅活檸檬酸桿菌與奇球菌原生質(zhì)體融合 [J]. 微生物學(xué)通報(bào) , 2010, 37(7)∶ 975-980.

[10] Xu B, Jin Z H, Wang H Z, et al. Evolution of Streptomyces pristinaespiralis for resistance and production of pristinamycin by genome shuff l ing[J]. Appl Microbial Biotechnol, 2008, 80∶ 261-267.

[11] Jin Z H, Xu B, Lin S Z, et al. Enhanced production of spinosad in Saccharopolyspora spinosa by genome shuffling[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2009, 9∶ 125-133.

[12] Aldo Jose Pinheiro Dillon, Marli Camassola, Joao Antonio Pegas Henriques. Generation of recombinants strains to cellulases production by protoplast fusion between Penicillium echinulatum and Trichoderma harzianum[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2008, 43(6)∶403-409.

[13] 李 麗 , 房 杰 , 黃潔潔 , 等 . 單親滅活德氏乳桿菌和乳酸乳球菌原生質(zhì)體融合條件優(yōu)化[J].食品科學(xué), 2012,33(5)∶193-198.

[14] 王麗華 , 陳建華 , 李昌珠 , 等 . 光皮樹花藥愈傷組織的誘導(dǎo)[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究 , 2011, 29 (1)∶ 94-98.

[15] Prabavathy V R, Mathivanan N, Sagadevan E, et al. Ιntra-strain protoplast fusion enhances carboxymethyl cellulase activity in Trichoderma reesei[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 38∶719-723.

[16] 朱宏莉 ,宋紀(jì)蓉 ,張 嘉 , 等 . 果膠酶產(chǎn)生菌 ZH-g 的原生質(zhì)體形成與再生研究 [J]. 食品科學(xué) , 2006, 27(8)∶ 68-71.

[17] 武金霞 , 趙 睿 , 張賀迎 . 米曲霉種內(nèi)原生質(zhì)體融合選育優(yōu)良菌株 [J].中國釀造 , 2012, 31(2)∶ 132-136.

[18] 李昌珠 , 王麗華 , 陳建華 , 等 . 光皮樹花藥愈傷組織原生質(zhì)體分離的研究 [J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào) , 2012,32(4)∶135-139.

[19] 田 媛 , 苑社強(qiáng) , 白曉青 , 等 . 康氏木霉原生質(zhì)體制備與再生研究 [J]. 中國釀造 , 2010, 7∶ 75-79.

[20] 韓 璞 , 田洪濤 , 苑社強(qiáng) , 等 . 羅伊氏乳桿菌原生質(zhì)體的制備與再生條件的研究 [J]. 中國食品學(xué)報(bào) , 2010, 10(1)∶10-18.

Protoplast preparation and regeneration conditions of Penicillium Q5 and Bacillus subtilis k3

LΙ Miao, ZENG Bai-quan, FENG Jin-ru
(School of Life of Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

The optimum conditions for the formation, regeneration and deactivation of protoplasts of Penicillium Q5 and Bacillus subtilis K3 were studied. The high-quality protoplasts of Penicillium Q5 and Bacillus subtilis K3 have been prepared by using enzymatic hydrolysis method. Through the tests, the conditions including microbial growth, the content of cellulase and time for reaction and the optimal inactivated time were optimized. The amount of protoplast from Penicillium Q5 gained a maximum, 7.35×106cfu/mL, and the corresponding above used values were 0.5% Glycolic, 10% sugar, 10 mg/mL lysozyme and snail enzyme (1 ︰ 1), 3 hours, and 35 ℃ . While the product of protoplast preparation and regeneration from Bacillus subtilis K3 reached the top, and the amount of protoplast from K3 maximized 1.46×107cfu/mL, and the corresponding above used values were 4 U/mL penicillin, 1 mg/mL lysozyme, 1 hours, and 35 ℃ . The period of the optimal heat inactivation in 65 ℃ was 1 hour for Penicillium Q5, while 2.5 hours for Bacillus subtilis K3. And the time of ultraviolet inactivation was 3 min for Penicillium Q5, and 5 min for Bacillus subtilis K3. The f i ndings provided a suitable material for protoplast fusion between Penicillium Q5 and Bacillus subtilis K3, which products high-yield cellulase with resistance.

Penicillium Q5; Bacillus subtilis K3; protoplast preparation; protoplast regeneration; protoplast deactivation

S718.8

A

1673-923X(2013)12-0174-07

2013-08-16

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012NK3113）；湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13A123)資助

李 淼（1989-），女，碩士研究生；E-mail：heart1001@126.com

曾柏全（1967-），男，湖南邵東人，副教授，博士；E-mail：baiquanzhn@163.com

[本文編校：邱德勇]