王 茜 ，張冬林 ，楊模華 ，邵俊培 ，李志輝 ，洪永輝

(1.林業(yè)生物技術湖南重點實驗室，湖南長沙410004；2.中南林業(yè)科技大學 林學院，湖南長沙410004；3. University of Georgia, USA GA 30602；4. 福建省漳平五一國有林場，福建漳平364400；5. 福建省龍巖市馬尾松研究中心，福建漳平 364400)

馬尾松優(yōu)良家系優(yōu)株ISSR遺傳距離分析

王 茜1,2，張冬林3，楊模華1,2，邵俊培1，李志輝1，洪永輝4,5

(1.林業(yè)生物技術湖南重點實驗室，湖南長沙410004；2.中南林業(yè)科技大學 林學院，湖南長沙410004；3. University of Georgia, USA GA 30602；4. 福建省漳平五一國有林場，福建漳平364400；5. 福建省龍巖市馬尾松研究中心，福建漳平 364400)

采用ΙSSR分子標記對福建漳平五一林場28個馬尾松優(yōu)良家系最優(yōu)單株進行遺傳分析，計算兩兩之間的遺傳距離，進行遺傳結構分析，結果表明：10條多態(tài)性引物共檢測到99個位點（從250～2 300 bp），其中93個多態(tài)位點，多態(tài)位點百分率(P)為93.94%；28個馬尾松無性系兩兩之間的分子遺傳距離在0.212 1 ～0.565 6之間，遺傳距離大于0.5的無性系對有11組，遺傳距離小于0.25的無性系對有6組；在聚類分析自檢舉值為48處，可將28份馬尾松無性系分為9類，其中7個無性系單獨聚類，其他21個無性系聚成2類；遺傳距離較大的無性系組分別出現(xiàn)在不同的聚類中，表明這些無性系組兩兩之間具有相對較遠的親緣關系。本研究為馬尾松高世代育種群體的選育提供分子水平上的依據(jù)，為分子標記指導馬尾松育種奠定了一定的研究基礎。

馬尾松；ΙSSR；遺傳距離；雜種優(yōu)勢

馬尾松Pinus massoniana Lamb 為松科松屬常綠高大喬木，是我國南方松屬中分布范圍最廣、人工造林面積最大的重要用材樹種，經(jīng)濟價值高，可供工農業(yè)生產中的建筑、枕木、礦柱、制板、包裝箱、膠合板、制漿造紙等使用。馬尾松的遺傳改良已經(jīng)進入高世代種子園營建階段[1]。由種子園選育，經(jīng)子代測定而選出的優(yōu)良個體，用于高世代種子園營建過程中，有必要了解育種群體種質個體之間的遺傳背景和親緣關系，這樣在選擇家系最優(yōu)株作為高世代育種群體組成時，還需要考慮雜交親本間盡可能具有較高雜種優(yōu)勢的可能，才能獲得理想的種子園育種遺傳增益。當前，在遺傳和生理生化水平上，對親本間潛在雜種優(yōu)勢進行預測的方法主要有配合力法[2]、遺傳距離法[3-4]、葉綠體互補法[5]、同工酶法[6]、DNA 分子標記差異法[7]等?；赑CR的分子標記技術被廣泛應用于林木遺傳育種[8]等領域， DNA分子標記遺傳距離法已被應用于植物雜種優(yōu)勢的預測中。如黃光文等[9]利用ΙSSR分子標記對水稻9個品種的遺傳距離與其不完全雙列雜交F1代個體的生物量、穎花等性狀進行相關性研究，結果表明，遺傳距離與生物學產量的中親優(yōu)勢具有極顯著的正相關，穎花和株高的中親優(yōu)勢相關性也很顯著。張一等[10]對馬尾松雙列雜交親本遺傳距離與雜種生長優(yōu)勢進行了相關性分析，結果表明，隨著親本間遺傳距離的增大，子代生長性狀的雜種優(yōu)勢呈線性增加，因此，應用遺傳距離分析手段進行雜種優(yōu)勢預測具有一定的科學性。

試驗對福建漳平五一林場的28個馬尾松家系優(yōu)選單株進行ΙSSR分子標記分析，計算兩兩優(yōu)株之間的遺傳距離，并通過PAUP4.0，PopGene32和NTSYS-PC軟件對其進行遺傳結構和遺傳聚類分析，預測具有較高雜種優(yōu)勢，能用于高世代育種群體構建的優(yōu)株親本組合，為福建漳平五一林場馬尾松高世代育種群體的選育提供分子水平的選擇依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗材料采自福建漳平五一林場馬尾松家系實驗林，28個優(yōu)良單株為洪永輝等[11]報道的經(jīng)過子代測定，綜合分析后優(yōu)選出來的優(yōu)良家系最優(yōu)單株。2011年3月底采集幼嫩針葉，硅膠干燥帶回實驗室保存?zhèn)溆茫?8個優(yōu)良的單株（無性系源株）產地來源見表1。

表1 28個馬尾松家系優(yōu)株樣品來源Table 1 The 28 elite clones of masson pine (Pinus massoniana Lamb.)

1.2 總 DNA 的提取

采用改良的CTAB法提取基因組總DNA，經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，根據(jù)標準Marker條帶與DNA條帶亮度的比對，確定不同樣本的DNA濃度，最后稀釋至15ng/μL左右保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ΙSSR-PCR 擴增

擴增反應在美國ABΙ公司的9700型PCR儀上進行。PCR反應總體積為20 μL，其中包括1.5 μL 的 2.5 mmol/L dNTPs，0.75 μL 的 50 mmol/L的 MgCl2，2.0 μL 的 10×PCR buffer，0.6 μL 的primer，0.2 μL 5 U/μL 的 Taq DNA ploymerase，1μL 的 15 ng/μL 的 DNA 模板，經(jīng)優(yōu)化的 PCR 擴增程序是：94℃預變性5 min；38個循環(huán)，每個循環(huán) 94℃變性 30 s，56 ℃變性 45 s，72 ℃延伸 2 min；72℃延伸7 min，4℃保存。PCR擴增產物在1.4%的瓊脂糖凝膠（含0.1 mg/mL溴化乙錠）中電泳1.5 h，電泳液為0.5×TBE，將電泳分離的條帶在Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)中拍照保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

在Quantity One凝膠成像分析軟件的幫助下，對分析樣品的擴增條帶進行記錄，有擴增條帶賦值為“1”，無擴增條帶賦值為“0”，形成“0/1”數(shù)據(jù)矩陣圖。利用PAUP4.0、PopGene32和NTSYS－PC三種群體遺傳結構分析軟件對28個馬尾松優(yōu)株無性系的ΙSSR數(shù)據(jù)進行遺傳分析。

2 結果與分析

2.1 引物篩選及 PCR 擴增結果

本實驗先用3個馬尾松DNA樣品為模板，對100條ΙSSR引物（哥倫比亞大學提供的序列）進行PCR擴增，從中篩選出穩(wěn)定性強，重復性好，多態(tài)性豐富的引物10條（見表2），用于28個馬尾松樣品的PCR擴增，圖1為ΙSSR引物836在部分樣本中擴增后的電泳圖。10條ΙSSR多態(tài)性引物在所有無性系中共檢測到99個位點，位點大小位于 250 bp～ 2 300 bp之間，其中有 93個多態(tài)位點，多態(tài)位點百分率（P)為93.94%，每條引物的擴增條帶頻率平均值位于0.43～0.71之間（表2）。不同的引物在28個樣品中所檢測到的位點數(shù)在7～14之間，引物826檢測到的位點最多（14），引物834檢測到的位點數(shù)最少（7），每條引物平均檢測到9.3個多態(tài)位點。在所有的93個多態(tài)位點中，有4個多態(tài)位點的出現(xiàn)頻率小于0.16，79個多態(tài)位點的出現(xiàn)頻率大于0.16小于0.86，另有10個多態(tài)位點的出現(xiàn)頻率大于0.86（圖2）。

表2 篩選出的引物序列及其多態(tài)性Table 2 Sequences and polymorphism of ISSR primer

圖1 引物836在馬尾松部分樣本中的ΙSSR電泳圖Fig.1 Electrophoretic analysis of masson pine samples by primer 836

圖2 93 個多態(tài)位點的頻率分布Fig.2 Frequency distributions of 93 polymorphic alleles

2.2 遺傳距離分析

利用PAUP4.0遺傳分析軟件對28個馬尾松優(yōu)株無性系DNA的ΙSSR擴增結果進行遺傳距離分析，得到兩兩之間的遺傳距離。樣品間的遺傳距離在一定程度上能說明它們親緣關系的遠近。從遺傳距離表中發(fā)現(xiàn)，28個無性系兩兩之間的遺傳距離在0.2121～0.5656之間，遺傳距離最大的是181和195，兩無性系之間遺傳距離最小的是568和657；在所有的兩兩比較中，遺傳距離大于0.5的分別為：181與（195、34、127、666），519與（346、34），603與（666、392、655、6），392與194這11組無性系對。遺傳距離小于0.25的分別為：195與386，568與657，347與34，347與567，392與6，127與592這6對。

2.3 聚類分析

利用PAUP4.0對28個馬尾松家系優(yōu)株樣本進行群體遺傳結構聚類分析，采用鄰接聚類法（NJ）得到聚類圖（見圖3）。由圖3看出,在自檢舉值48的虛線處，有7個無性系如519、728、486、386、615、655、181分別各自單獨聚類，說明這7個無性系各自與其它無性系之間的親緣關系較遠，另外的21個無性系則分別聚為2大類，其中無性系332、603、30、85這四個無性系逐級聚類，說明它們之間的親緣關系很近，同樣，194、62、592這三個無性系，6、392、127這三個無性系，也逐級聚類，表明它們的親緣關系也非常近。對于這些親緣關系表現(xiàn)特別近的無性系組，在今后的雜交育種中，建設不宜進行組內雜交親本選擇，而應盡量選擇位于不同分類群中的無性系作為親本，以利用子代雜種優(yōu)勢獲得較高的遺傳增益。

圖3 28 個馬尾松家系優(yōu)株 PAUP 4.0 鄰接（NJ）聚類圖Fig. 3 Dendrogram among 28 elite clones of Pinus massoniana Lamb based on the genetic distances generated by PAUP 4.0

從產地種源來看，28個優(yōu)良家系優(yōu)株樣品中，有17個來自五一林場馬尾松種子園， 11個來自西陂林場馬尾松種子園，而在28個優(yōu)株無性系的聚類圖上，兩個種子園的樣品并沒有分別聚類，而是相互混合分散在各個聚類群中。這與兩個種子園在建園時，部分親本采用了同一無性系嫁接，因而部分親本基因型相同，這導致了來自不同種子園的家系子代，其親緣關系也還比較近，因此，當從表型方面選擇高世代育種材料時，既要考慮家系子代來源，也還要考慮它們之間實際的親緣關系，避免因近親繁殖而降低高世代種子園親本材料的遺傳多樣性水平。

2.4 遺傳多樣性分析

利用POPGENE32群體分析軟件對五一和西陂兩個種子園區(qū)的28個無性系進行群體遺傳多樣性分析（見表4），結果表明：五一林場種子園的總多態(tài)位點數(shù)為96，總多態(tài)位點百分比為96.97%，總 Shannon 信息指數(shù) (I)為 0.564 3，總Nei’s基因多樣性（h）為 0.386 3，與張冬林等[11]對湖南城步種子園遺傳多樣性的研究結果相比略高（Shannon信息指數(shù)和Nei’s基因多樣性分別為0.503 0，0.334 7）。表明本馬尾松家系優(yōu)株群體具有較高的遺傳多樣性水平。其總群體基因多樣性（Ht）為0.3860，群體內基因多樣性（Hs）為0.374 8，群體間基因分化系數(shù)為0.028 9，來自兩個種子園家系優(yōu)株群體間的遺傳變異約為2.89%，而存在于種子園家系優(yōu)株群體內的變異量高達97.11%，這與李志輝等[12-13]對馬尾松群體遺傳多樣性結構分析的研究結果一致，即馬尾松群體內存在著非常豐富的遺傳變異，基因多樣性水平高，群體間遺傳分化較小。張薇等[14]對福建馬尾松實生種子園自由授粉子代群體的研究結果表明，自由授粉子代群體的Shannon多樣性指數(shù)為1.034，Nei多樣度為0.574 0，這些多樣性測度指標明顯高于本研究中相關指標的賦值水平。我們對采樣策略進行的比較，發(fā)現(xiàn)，張薇等所取樣的實驗材料為馬尾松完全自由授粉子代實生苗群體[14]，而我們取樣的實驗材料為經(jīng)12年子代測定試驗后獲得的優(yōu)良家系最優(yōu)單株[11]，采樣策略不同，對種子園子代群體的選擇強度不一樣。因此，在高強度選擇取樣策略下，本論文中的Shannon多樣性指數(shù)以及Nei’s基因多樣性水平值與張薇等[13]研究結果比較，明顯的偏低。這樣的研究結果也為育種世代與育種群體的遺傳多樣性水平的負相關關系進一步提供了佐證，符合群體遺傳多樣性水平發(fā)展的一般規(guī)律，即隨著種子園育種世代的提高，其選擇強度增加，與此同時育種群體的遺傳多樣性水平確會有一定程度的下降。

表3 馬尾松群體遺傳多樣性分析Table 3 Genetic analysis of Pinus massoniana Lamb.

2.5 馬尾松家系優(yōu)株間 NTSYS-PCA 主成分分析

利用NTSYS-PC軟件對28個馬尾松家系優(yōu)株進行主成分分析，計算Jaccard系數(shù)相似性矩陣，進行PCA主成分分析（見圖4）。28個無性系聚類結果與PAUP 4.0結果相似。在PCA聚類圖示的密集和分散度的模式中，對于密集區(qū)域的樣本，其遺傳一致度高，在種質篩選時應綜合考慮，選擇其一便可；而對那些分散分布的無性系，說明其種質特異性較高，可作為高世代親本選擇時的重點選擇對象。由此，我們可對分布密集區(qū)的樣本進行篩選，而對分散區(qū)的樣本予以保留，特別是那些處于外圍的樣本，如34、592、519、603和181這五個無性系可作為重點選擇對象。

3 結論與討論

圖4 28 個家系優(yōu)株的 NTSYS-PC 主成分分析Fig.4 Principal component analysis by NTSYS-PC software for 28 clones

親本遺傳距離與雜交優(yōu)勢的相關性研究為選擇育種提供了一定的理論依據(jù)[15]。對馬尾松雙列雜交親本遺傳距離與雜種生長優(yōu)勢的相關性分析結果表明，隨著親本間遺傳距離的增大，子代生長性狀的雜種優(yōu)勢呈線性增加[10]，因此，在選擇雜交育種親本時，一方面考慮表型優(yōu)株，同時也考慮選擇遺傳距離較大的親本對，可在一定程度上提高子代雜種優(yōu)勢水平，從而獲得胸徑、材積等表型性狀優(yōu)良的子代，以獲得更高的種子園育種遺傳增益。

本試驗對馬尾松28個家系優(yōu)株進行遺傳距離聚類及遺傳關系分析，并以此可作為高世代雜交育種親本選擇時的部分依據(jù)，結果表明：

1）根據(jù)PAUP4.0聚類分析結果，作為育種群體的親本，應盡量選擇遺傳距離大于0.5的組合：181和（195、34、127、666），519和（346、34），603和（666、392、655、6），392和 194這11對無性系；而應盡量避免遺傳距離小于0.25的無性系對。根據(jù)NTSYS-PC軟件分析結果，可重點選擇34、592、519、603和181這五個無性系作為育種親本進行雜交育種，子代獲取較高雜種優(yōu)勢的可能性更大，并能產生較高的種子園育種遺傳增益。

2）對這28個最優(yōu)家系的最優(yōu)單株進行PAUP 4.0聚類分析表明：在自檢舉值為48處，7個無性系樣品單獨各自聚類，而其他21個無性系樣品分別聚為2類。除了無性系368與194外，其余10組遺傳距離大于0.5的無性系對，成對兩個無性系均分別出現(xiàn)在不同的聚類群中。這說明，采用分子標記對育種群體進行分子遺傳結構分析，能一定程度地闡明育種群體的遺傳背景，揭示其親緣關系的遠近，從而可為指導馬尾松高世代種子園營建提供分子水平的理論依據(jù)。

3）從各家系優(yōu)株無性系的產地來源來看，盡管地理距離在一定程度上決定了群體間的遺傳距離及遺傳多樣性水平，但隨著種子園育種改良世代的增加，這種地理距離的決定關系會因種子園世代的提高而減弱；尤其是隨著選擇強度的增加，育種群體的遺傳多樣性水平會有一定程度的下降。因此，為有預見性地拓寬高世代種子園育種親本的遺傳多樣性水平，應適當增加上一世代育種繁育系統(tǒng)之外的優(yōu)良親本，并可借助分子標記技術手段對進入高世代育種群體的樣本進行遺傳多樣性水平和親緣關系檢測，以提高雜種優(yōu)勢預測水平。

[1] 馬常耕. 高世代種子園營建研究進展[J]. 世界林業(yè)研究, 1994, (1)∶ 31-38.

[2] 朱旭東. 雜交水稻主要性狀雜種優(yōu)勢和配合力及K17A恢復基因的遺傳和SSR分子標記研究[D]. 長沙∶ 湖南農業(yè)大學, 2009.

[3]趙慶勇 , 朱 鎮(zhèn) , 張亞東 , 等 . SSR 標記遺傳距離與粳稻雜種優(yōu)勢的相關性分析 [J]. 中國水稻科學 , 2009, 23(2)∶ 141- 147.

[4]譚 靜 , 番興明 , 楊峻蕓 , 等 . 玉米分子標記遺傳距離與產量雜種優(yōu)勢關系的研究 [J]. 西南農業(yè)學報 ,2004, 17(3)∶ 278-281.

[5]曾孟潛, 羅會馨, 邵勤田. 玉米雜種及其親本葉綠體光化學活性和同工酶的研究 [J]. 遺傳學報 , 1979, 6(1)∶ 39

[6] 黃啟強, 王蓮輝. 馬尾松天然群體同工酶遺傳變異[J]. 遺傳學報 , 1995, 22(2)∶ 142-151.

[7]楊 蛟 , 張 濤 , 蔣開鋒 , 等 . 分子標記遺傳距離用于水稻雜種優(yōu)勢預測研究進展[M]. 第1屆中國雜交水稻大會論文集, 2010, 312-325.

[8]李少鋒, 蘇曉華, 張冰玉. 林木基因克隆研究進展[J].植物學報 ,2011,46(1)∶79-107

[9]黃光文 , 歐立軍 , 陳覺梁 , 等 . 水稻 ΙSSR 標記遺傳距離與雜種優(yōu)勢的相關性研究 [J]. 雜交水稻 , 2010, (S1)∶ 326-331.

[10] 張 一 , 周志春 , 金國慶 , 等 . 馬尾松雙列雜交親本遺傳距離與雜種生長優(yōu)勢相關性分析[J].南京林業(yè)大學學報∶自然科學版 , 2010, 34(1)∶ 9-14.

[11] 洪永輝 , 林文獎 , 黃以法 . 12 年生馬尾松種子園半同胞家系生長性狀變異分析與優(yōu)良家系選擇[J] . 南京林業(yè)大學學報∶自然科學版 , 2010, 34(4)∶ 26- 30.

[12] 張冬林 , 楊玉潔 , 楊模華 , 等 . 湖南城步馬尾松種子園遺傳多樣性的 ΙSSR 研究 [J]. 中南林業(yè)科技大學學報 , 2010, 30(12)∶ 6-10.

[13] 李志輝,陳 藝,張冬林,等. 廣西馬尾松天然林古蓬和浪水種源群體遺傳多樣性ΙSSR分析[J]. 中國農學通報, 2009, 25(16)∶ 116-119.

[14] 張 薇 , 龔 佳 , 季孔庶 . 馬尾松實生種子園遺傳多樣性分析[J]. 分子植物育種 , 2008, 6(4)∶ 717-723.

[15] Hui-Zhong Wang, Zhen-Xing Wu, Jiang-Jie Lu, et al. Molecular diversity and relationships among Cymbidium goeringii cultivars based on inter-simple sequence repeat (ΙSSR) markers[J]. Genetic, 2009, 136∶391-399.

ISSR analysis of genetic distance of Pinus massoniana Lamb. Elite clones

WANG Qian1,2, ZHANG Dong-lin3, YANG Mo-hua1,2, SHAO Jun-pei1, LΙ Zhi-hui1, HONG Yong-hui4,5
(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Forestry Biotechnology, Changsha 410004, Hunan, China; 2.College of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 3. University of Georgia, USA GA 30602; 4.Wuyi National Forest Farm Fujian Province, Zhangping 364400, Fujian, China; 5. Mason Pine Research Center of Longyan Fujian Province, Zhangping 364400, Fujian, China)

ΙSSR (Ιntro-simple Sequence Repeat) were employed to study the genetic analysis and GD ( genetic distance) among 28 elite clones in Pinus massoniana Lamb. The results indicated that 10 polymorphism markers totally produced 99 alleles (size ranged from 250 to 2300bp) and 93 were polymorphic, the percentage of polymorphic alleles (P) was 93.94%. The GD among 28 clones ranged from 0.2121 to 0.5656. There were 11 pairs of clones’ GD larger than 0.5 and 6 pairs of clones’ GD less than 0.25; The 28 clones were clustered into nine groups at the value of 48, of which seven clones were clustered separately and the other 21 clones were clustered into two groups; Those pairs of clones with larger GD appeared in different groups which showed a distant relationship with each other. These f i ndings provided some insight into the selection of elite clones in breeding population on advanced generation orchard and it would guide the breeding work of Pinus massoniana Lamb more eff i ciently at the molecular level.

Pinus massoniana Lamb; ΙSSR marker; genetic distance; hybrid vigour

S791.248

A

1673-923X(2013)12-0072-05

2013-04-01

湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金項目資助（09B112）

王 茜（1988-），女，山西運城人，碩士研究生，從事林木定向育種理論與技術研究

楊模華（1974-），博士，副教授，主要從事森林培育教學和科研；E-mail：ymh163@163.com

[本文編校：吳 彬 ]