馬 力，陳永忠 ，彭邵鋒 ，王湘南 ，陳隆升，王 瑞 ，楊小胡 ，羅 健

（1.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.國(guó)家油茶工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

油茶粕最優(yōu)培養(yǎng)基及混菌生產(chǎn)蛋白飼料的研究

馬 力1,2，陳永忠1,2，彭邵鋒1,2，王湘南1,2，陳隆升1,2，王 瑞1,2，楊小胡1,2，羅 健1,2

（1.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.國(guó)家油茶工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

以油茶粕為原料，篩選生產(chǎn)蛋白飼料的最優(yōu)培養(yǎng)基及菌種組合。首先對(duì)油茶粕進(jìn)行成分分析，結(jié)果表明：兩組處理蛋白質(zhì)含量均為9%以上，是一種很好的飼料原料；接著以米曲霉初篩油茶粕生產(chǎn)蛋白飼料的發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得了較優(yōu)的培養(yǎng)基配方為：熱水脫皂的油茶粕16 g，麥麩1 g，葡萄糖2 g，(NH4)2SO41 g，水19 g。最后，通過(guò)平板點(diǎn)種試驗(yàn)及三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)，獲得油茶粕生產(chǎn)蛋白飼料的最佳菌種組合及接種比例：地衣芽孢桿菌10181︰黑曲霉︰葡萄汁酵母1445︰米曲霉=1︰1︰1︰1。發(fā)酵生成的粗蛋白含量為16.94%，較未發(fā)酵時(shí)的10.82%，提高了56.56%。

油茶粕；混菌；蛋白飼料

油茶Camellia oleifera Abel.，又稱茶油樹(shù)、白花茶、中果油茶、茶子樹(shù)等，屬山茶科Theaceae山茶屬Camellia L．植物是我國(guó)特有的木本食用油料樹(shù)種，有2300多年的栽培和利用歷史，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物，與烏桕、油桐和核桃并稱為我國(guó)四大木本油料植物[1-3]。目前，我國(guó)油茶面積約有300萬(wàn)hm2，油茶籽年產(chǎn)量100萬(wàn) t左右，年產(chǎn)茶油約26萬(wàn) t，產(chǎn)值約110億元[4-5]。

油茶全身都是寶。葉可凈化空氣，綠化環(huán)境；花可觀賞，作蜜源；根可保持水土，涵養(yǎng)水源；根皮還可入藥；莖質(zhì)地細(xì)密，韌性較好，可用于制作木器、農(nóng)具等；種子榨取的油—茶油是一種優(yōu)質(zhì)食用油，不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上，以油酸為主，還富含亞油酸和亞麻酸、維生素E、生育酚、角鯊烯等營(yíng)養(yǎng)成分，被譽(yù)為“東方橄欖油”，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織重點(diǎn)推薦為健康型高級(jí)食用植物油[6-7]；茶油還能通過(guò)油脂的深加工生產(chǎn)高級(jí)保健食用油和高級(jí)天然護(hù)膚化妝品等；油茶粕可提取茶皂素、制刨光粉和復(fù)合飼料[8]；茶殼可提糠醛、鞣料和制活性炭等[9]，發(fā)展油茶生產(chǎn)對(duì)提高我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)和人民生活水平具有重大意義。

油茶粕是油茶提油后的剩余物，近年我國(guó)年產(chǎn)油茶粕70多t，但大多數(shù)被廢棄掉或廉價(jià)出口到東南亞等國(guó)，有效資源未得到充分利用。我國(guó)鐘海雁教授、鄧桂蘭教授等已做過(guò)相關(guān)研究證實(shí)，油茶粕通過(guò)菌種發(fā)酵，可使部分糖類、纖維素等主要成分轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)[10-11]。本研究通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和高效發(fā)酵菌株的篩選，以達(dá)到提高油茶粕蛋白質(zhì)的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

米曲霉、黑曲霉、葡萄汁酵母1445、熱帶假絲酵母1779、地衣芽孢桿菌10181、枯草芽孢桿菌（均購(gòu)于湖南省微生物研究所）。

1.2 試驗(yàn)原料

油茶粕（購(gòu)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油脂與蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)室），將油茶粕置于70℃電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱中烘干至水分不再發(fā)生變化。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熱水脫皂

油茶粕粉碎、過(guò)篩→加3倍清水→煮沸2 h（不斷攪拌，以防止焦灼）→過(guò)濾，濾渣在清水中浸泡24 h，反復(fù)洗滌，除去上層溶液→過(guò)濾，烘干備用。

1.3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，可分解油茶餅粕中的粗蛋白質(zhì)、纖維素、糖類物質(zhì)等，故試驗(yàn)用米曲霉初步篩選發(fā)酵培養(yǎng)基。以油茶粕為主，麥麩為輔，設(shè)計(jì)了4種培養(yǎng)基配方，見(jiàn)表1。以米曲霉發(fā)酵，在溫度28℃下培養(yǎng)3 d。發(fā)酵完后測(cè)定培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的含量。

表1 培養(yǎng)基配方Table 1 Formulas of mediums

1.3.3 配伍菌種篩選

將白地霉、黑曲霉、米曲霉、地衣芽孢桿菌10181、熱帶假絲酵母1779及葡萄汁酵母斜面分別用無(wú)菌水洗下，30℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h，分別接入到飼用油茶餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)72 h，觀察固體平板上各菌株的生長(zhǎng)情況，同時(shí)，測(cè)定培養(yǎng)基發(fā)酵前后蛋白質(zhì)含量的變化。

根據(jù)各試驗(yàn)菌的發(fā)酵結(jié)果，選用黑曲霉為指示菌。將黑曲霉接種于優(yōu)化的培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)48 h后，再分別點(diǎn)種其他待選菌，28℃下培養(yǎng)72 h，觀察各菌株的生長(zhǎng)情況。

1.3.4 菌種比例及組合優(yōu)化

根據(jù)平板點(diǎn)種刺激圈試驗(yàn)，選擇與指示菌配伍的菌種2株，組成A組菌和B組菌。

(1) A組菌兩菌株接種比的確定。將斜面菌種用無(wú)菌水洗下，以接種比為5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5，接種量為10%，分別接入到三角瓶發(fā)酵飼用油茶餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，105℃烘干至恒重，測(cè)定其粗蛋白含量。

(2) B組菌兩菌株接種比的確定方法同A組菌。

(3) 4個(gè)菌種的混合比。將斜面菌種用無(wú)菌水洗下，以A組菌與B組菌的接種比分別為5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5，接種量為10%，分別接入到三角瓶發(fā)酵飼用油茶餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，105℃烘干至恒重，測(cè)定其粗蛋白含量。

1.4 測(cè)定方法

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：凱氏定氮法（GB/T5009.5-2003）；

粗脂肪的測(cè)定：索氏抽提法；

粗纖維含量測(cè)定：重量法；

可溶性總糖測(cè)定：蒽酮法；

皂素的測(cè)定采用：比色法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶粕化學(xué)成分分析

油茶粕的主要成分包括蛋白質(zhì)、茶皂素、粗纖維、可溶性糖等。將油茶粕和熱水脫皂的油茶粕進(jìn)行成分測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 油茶粕主要化學(xué)成分?Table 2 Main chemical composition of oil-tea camellia meal %

從表1可以看出，兩組處理蛋白質(zhì)含量均為9%以上，是一種很好的飼料原料。熱水脫皂后的油茶粕，水溶性物質(zhì)茶皂素和可溶性糖均有所降低，分別為3.81%和2.88%，脫皂率高達(dá)79%。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

優(yōu)良的培養(yǎng)基可以為微生物的生長(zhǎng)提供所需的全部營(yíng)養(yǎng)素，包括C源和N源[13]。米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，可使油茶粕中的粗蛋白質(zhì)、纖維素、糖類物質(zhì)分解中微生物生長(zhǎng)所需的C源和N源，故試驗(yàn)用米曲霉來(lái)初步篩選發(fā)酵培養(yǎng)基。將米曲霉接種于4種培養(yǎng)基配方中，發(fā)酵前后蛋白質(zhì)含量見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵后培養(yǎng)基配方蛋白質(zhì)含量的變化Fig.1 Changes of protein content of mediums after fermentation

由圖1可知，各油茶粕培養(yǎng)基發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量均有一定的提高，提高率可達(dá)28.00%。其中，以熱水脫皂后的油茶粕制備的培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量均高于相對(duì)應(yīng)的以未處理的油茶粕制備的，說(shuō)明油茶粕的茶皂素可以抑制微生物生長(zhǎng)；4組培養(yǎng)基配方中，培養(yǎng)基配方Ⅱ的蛋白質(zhì)提高率較培養(yǎng)基配方Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的大，說(shuō)明培養(yǎng)基配方Ⅱ的營(yíng)養(yǎng)成分組成較合理，利于微生物的生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，最佳的培養(yǎng)基配方為：熱水脫皂的油茶粕16 g，葡萄糖2 g，麥麩1 g，(NH4)2SO41 g，水19 g。

2.3 配伍菌種篩選

混合菌種發(fā)酵效果優(yōu)于單個(gè)菌種發(fā)酵，因混合菌種發(fā)酵可多個(gè)菌種之間互相補(bǔ)償缺陷，進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵[14-16]。點(diǎn)種各菌株處黑曲霉的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。

表 3 黑曲霉的生長(zhǎng)情況?Table 3 Growth conditions of Aspergilluse niger

地衣芽孢桿菌10181、葡萄汁酵母1445與米曲霉可明顯刺激黑曲霉生長(zhǎng)，因此確定這3種菌為配伍菌種。

2.4 菌種比例及組合優(yōu)化

2.4.1 雙菌種接種比的確定

根據(jù)配伍菌種的篩選結(jié)果，結(jié)合黑曲霉和米曲為同一屬的特性，確定地衣芽孢桿菌與黑曲霉為A組，葡萄汁酵母和米曲霉為B組，發(fā)酵確定雙菌種的接種混合比。

圖2 不同比例地衣芽孢桿菌10181與黑曲霉產(chǎn)生粗蛋白含量Fig.2 Protein contents in different ratios of B. licheniformis 10181 and A. niger fermentation

圖3 不同比例葡萄汁酵母1445與米曲霉產(chǎn)生粗蛋白含量Fig.3 Protein contents in different ratios of S. uvarum 1445 and A. oryzae fermentation

由圖2和圖3可知菌組A和菌組B在接種比分別為1：1和1：1時(shí)粗蛋白含量最高，因此，接種比為1：1時(shí)為雙菌種的最佳接種比。

2.4.2 菌組接種比的確定

將菌組A和菌組B按比例接種，發(fā)酵，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同比例組菌A與B菌株組產(chǎn)生粗蛋白含量Fig.4 Protein contents in different ratios of A group and B group fermentation

由圖4可知，在菌組A和菌組B的接種比為1︰1時(shí), 粗蛋白含量最高?？傻?，油茶粕生產(chǎn)蛋白飼料輔料的最佳接種混合比為地衣芽孢桿菌10181︰黑曲霉︰葡萄汁酵母1445︰米曲霉=1︰1︰1︰1。發(fā)酵生成的粗蛋白含量為16.94%，較未發(fā)酵時(shí)的10.82%提高了56.56%。

3 結(jié)果與討論

（1）油茶粕是榨油后的主要副產(chǎn)物，由殘油、茶皂素、可溶性糖、蛋白質(zhì)等有效成分組成，將其高效利用，可以大幅度提高油茶的綜合價(jià)值。將未經(jīng)處理的油茶粕和熱水脫皂后的油茶粕進(jìn)行各組成成分測(cè)定，兩組處理蛋白質(zhì)含量均為9%以上，并含可溶性糖、纖維素等可被微生物利用的物質(zhì)，是一種很好的飼料原料。熱水脫皂后的油茶粕，脫皂率高達(dá)79%，是一種有效的茶皂素提取方式。因此，油茶粕利用微生物法生產(chǎn)蛋白飼料技術(shù)與熱水提取高純度、高活性茶皂素技術(shù)有機(jī)結(jié)合以提高油茶粕的利用率可作為下一步研究重點(diǎn)。

（2）優(yōu)良的培養(yǎng)基可為微生物的生長(zhǎng)提供所需的C源、N源等營(yíng)養(yǎng)素。以米曲霉初步篩選油茶粕發(fā)酵培養(yǎng)基，得出最佳配方為：熱水脫皂的油茶粕16 g，葡萄糖2 g，麥麩1 g，(NH4)2SO41 g，水19 g。其中，熱水脫皂的油茶粕發(fā)酵效果優(yōu)于較未處理的油茶粕的，因油茶粕的茶皂素抑制了微生物生長(zhǎng)，在油茶粕利用微生物法生產(chǎn)蛋白飼料前必須進(jìn)行脫皂素處理。

（3）油茶粕通過(guò)多菌種的協(xié)同發(fā)酵，油茶粕中的多糖、纖維素等物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)。通過(guò)平板點(diǎn)種試驗(yàn)，確定與黑曲霉配伍的菌種為：地衣芽孢桿菌10181、葡萄汁酵母1445與米曲霉；根據(jù)三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)，獲得了油茶粕發(fā)酵產(chǎn)高蛋白的最優(yōu)菌種組合及發(fā)酵比例為地衣芽孢桿菌10181︰黑曲霉︰葡萄汁酵母1445︰米曲霉=1︰1︰1︰1。發(fā)酵生成的粗蛋白含量為16.94%，較未發(fā)酵時(shí)的10.82%提高了56.56%，從而達(dá)到了提高產(chǎn)品的粗蛋白含量的目的。

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Protein feed made from optimum culture medium and mixed strains of Camellia meal

MA Li1,2, CHEN Yong-zhong1,2, PENG Shao-feng1,2, WANG Xiang-nan1,2, CHEN Long-sheng1,2, WANG Rui1,2, YANG Xiao-hu1,2, LUO Jian1,2
(1. Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China; 2. National Oil-tea Camellia Engineering &Technology Research Center, Changsha 410004, Hunan, China)

By taking Camellia cake as the raw materials, the screening tests were conducted in order to fi nd out the optimal medium and bacteria group for producing feeding-protein in oil-tea Camellia defatted cake. Firstly, the cake’s composition was analyzed, the results show that the crude protein contents of two groups of cakes were over more than 9%, the cakes are good protein feeds; which contain is a good feed ingredients; then the optimum fermentation medium was obtained by Aspergilluse niger fermentation, the media components is as followings: 16 g Camellia oleifera meal removed SOAP in hot water, 1 g wheat bran, 2 g glucose, 1 g (NH4)2SO4, 19 g water; fi nally, through the plate dibbling test and conical fl ask fermentation, the optimum multi-strains ratio of protein feed was obtained as followings: Bacillus licheniformis 10181: Aspergilluse niger: Saccharomyces uvarum 1445: Aspergillus oryzae, the ratio of them was=1︰1︰1︰1. The crude protein content generated by fermentation under this fermentation condition could reach 16.94%, which was 56.56% higher than that (10.82%) of the control.

Camellia cake; mixed strains; protein feed

S727.3

A

1673-923X(2013)10-0034-04

2013-02-26

“國(guó)家油茶工程技術(shù)研究中心”（2011FU125X11）的部分研究?jī)?nèi)容

馬 力（1982-），女，湖南湘潭人, 助理研究員，博士研究生，主要從事油茶加工及副產(chǎn)物綜合利用研究；

E-mail:supermarry1@163.com

[本文編校：吳 彬]