葛躍，吳潔，趙昀

(蘇州大學(xué)唐仲英血液學(xué)研究中心，江蘇蘇州 215123)

人類慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是源自造血干細(xì)胞的惡性血液腫瘤。依據(jù)疾病的進(jìn)程可分為慢性期、加速期和急變期3個(gè)階段。伊馬替尼(imatinib methylate，IM)可抑制酪氨酸激酶(BCR-ABL)活性，在慢性期慢性粒細(xì)胞白血病治療中有效，但很難達(dá)分子學(xué)緩解(MR)［1］，無法治愈該疾病。因而，尋找新靶點(diǎn)、設(shè)計(jì)新藥物成為CML研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［2］。

1988年Schneider等［3］鑒定到一組在 NIH 3T3細(xì)胞處于血清饑餓或細(xì)胞接觸性抑制狀態(tài)而表達(dá)上調(diào)的基因，稱之為生長(zhǎng)抑制特異性基因(growth arrestspecific genes，GAS)。它們編碼的蛋白產(chǎn)物包括Gas1、Gas2……Gas8等，但它們不存在序列同源性或共同結(jié)構(gòu)特征，細(xì)胞定位和功能也各異［4］。Gas2蛋白產(chǎn)物包含N-端的CH(calponin homology)結(jié)構(gòu)域和C-端的GAR結(jié)構(gòu)域。Gas2是微絲、微管相關(guān)蛋白，參與細(xì)胞分裂的調(diào)控［5］，比如，Gas2和N-端缺失的Gas2變體能抑制爪蟾胚胎細(xì)胞的生長(zhǎng)［6］。Gas2也是Caspase的底物參與細(xì)胞凋亡［7］。另外，Gas2還是鈣蛋白酶Calpain的內(nèi)源性抑制劑，可通過抑制Calpain的活性、穩(wěn)定p53而調(diào)控凋亡反應(yīng)［8］。

Gas2在人類骨髓增生性疾病中異常表達(dá)，這類疾病包括 IM(idiopathic myelofibrosis，骨髓纖維化)、PV(polycythemia vera，真性紅細(xì)胞增多癥)、ET(essential thrombocythemia，原發(fā)性血小板增多癥)和 CML等。Kronenwett等［9］使用 CML患者與正常骨髓及 G-CSF動(dòng)員的外周血CD34+細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜研究，結(jié)果提示Gas2在CML患者中較正常細(xì)胞表達(dá)增高。此外，兩項(xiàng)獨(dú)立研究顯示在CML從慢性期到急變期的轉(zhuǎn)化過程中，Gas2的表達(dá)隨疾病的進(jìn)程升高［10-11］。Vannucchi等［12］比較IM患者與正常供體CD34+細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)Gas2高表達(dá);而后使用IM、PV及ET患者與正常供體骨髓的CD34+細(xì)胞進(jìn)行Q-RTPCR驗(yàn)證，證實(shí)Gas2在這3種疾病中都顯著較正常細(xì)胞表達(dá)增高。

Gas2Δ171-314和Calpain結(jié)合但不抑制其活性，卻解除Gas2和內(nèi)源性抑制劑Calpastatin對(duì)Calpain的抑制作用［8］，因而被稱為 Gas2的顯性負(fù)性突變體(Gas2DN)。在多種腫瘤細(xì)胞中Calpain能獨(dú)立于GSK3β/蛋白酶體途徑調(diào)控 β-catenin 的降解［13］;Huang等［14］發(fā)現(xiàn) Gas2Δ171-314 能激活細(xì)胞內(nèi)被 Gas2 或Calpastatin抑制的 Calpain活性，促進(jìn) β-catenin的降解，從而抑制BCR-ABL+的U937細(xì)胞或小鼠骨髓祖細(xì)胞響應(yīng)GM-CSF刺激的細(xì)胞增殖，這與Calpain活化、β-catenin降解及其轉(zhuǎn)錄活性的降低相關(guān)。

本研究使用慢病毒在人慢性髓細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株中過表達(dá) Gas2、Gas2Δ171-313和 Gas2Δ1-170，研究它們能否對(duì)K562細(xì)胞增殖有抑制作用，這種抑制作用對(duì)細(xì)胞周期、凋亡和衰老的影響，這種抑制作用能否與IM具有協(xié)同性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562和人胚腎293T細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、pMD19-T載體、T4DNA 連接酶、XhoI、EcoRI、BamHI、XbaI、PstI、HindⅢ、BglⅡ限制性內(nèi)切酶均購于 TaKaRa公司。PCR引物合成及基因序列檢測(cè)均由上海生工生物工程公司完成。鼠抗人單克隆 α-Tubulin抗體購于Sigma公司，鼠抗人單克隆Gas2抗體(識(shí)別N端)和兔抗人單克隆Gas2抗體(識(shí)別C端)均購于Abcam公司。甲基纖維素購于 StemCell Technologies公司。Calpain活性檢測(cè)試劑盒購于Biovision公司。β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)試劑盒購于碧云天公司。

1.1.3 主要儀器 流式細(xì)胞分析及分選儀(Becton Dickinson，美國(guó))，高速離心機(jī)(Beckman Coulter，美國(guó))，紫外凝膠成像儀(Bio-Rad，美國(guó))，自動(dòng)沖片機(jī)(Kodak，德國(guó))，垂直電泳儀和轉(zhuǎn)印電泳儀(天能，中國(guó))，PCR 儀(Biometra，德國(guó))，多功能讀板機(jī)(Molecular Devices，中國(guó))，智能圖像導(dǎo)航儀(Olympus，日本)，倒置顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Gas2基因及其變體的克隆 利用PCR的方法分別擴(kuò)增Gas2的編碼區(qū)及兩種Gas2變體(Gas2Δ171-313和Gas2Δ1-170);上下游引物中引入BamHⅠ識(shí)別序列，便于克隆入慢病毒表達(dá)載體。

1.2.2 慢病毒的制備 將慢病毒表達(dá)載體與ΔR、VSV-G、Rev 3種包裝質(zhì)粒通過磷酸鈣沉淀方式共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后48和72 h的培養(yǎng)上清，過濾分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆茫?6］。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)過表達(dá)的蛋白 收集4×106YFP+細(xì)胞，PBS清洗2次，加入蛋白裂解液，冰上裂解15 min，4℃14 000×g離心20 min，收集上清并蛋白定量。蛋白樣本加入5×SDS加樣緩沖液，100℃煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，2%脫脂牛奶稀釋一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗膜5次，5 min·次-1，加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，最后用ECL顯影［17］。

1.2.4 細(xì)胞增殖和集落生成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):24孔板中每孔種植2×104YFP+細(xì)胞，培養(yǎng)的第3天和第6天分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。集落生成(colony-forming cell，CFC)實(shí)驗(yàn):在有雙抗和IMDM培養(yǎng)基的甲基纖維素中加入300個(gè)YFP+細(xì)胞，混勻后接種到直徑為3.5 cm小皿中，37 ℃培養(yǎng)，2 周后計(jì)數(shù)［16］。

1.2.5 檢測(cè)Calpain活性 收集2×106YFP+細(xì)胞，PBS清洗2次，加入100 μl裂解液，冰上裂解20 min，10 000×g離心1 min，收集上清并進(jìn)行蛋白定量。取50 μg 蛋白，加入 10 μl反應(yīng)緩沖液，5 μl Calpain 底物，并加入一定量緩沖液至總體積100 μl。37℃避光反應(yīng)1 h。多功能讀板機(jī)上檢測(cè)400 nm和505 nm波長(zhǎng)處吸光度值。

其工作原理是：通過旋轉(zhuǎn)盤根壓蓋來擠壓銅壓套，銅壓套壓緊盤根，盤根在密封函內(nèi)彈簧的作用下被縱向擠壓發(fā)生橫向膨脹，從而密封柱塞與密封函的環(huán)形空間，防止高壓水刺漏及空氣進(jìn)入工作腔。

1.2.6 細(xì)胞周期分析 取1×106YFP+細(xì)胞，70%乙醇固定過夜，加入 RNase A(100 μg·ml-1)，37 ℃避光孵育30 min，再加入碘化丙啶(40 μg·ml-1)，4℃ 避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)［18］。數(shù)據(jù)使用Flow Jo軟件進(jìn)行分析。

1.2.7 β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老 離心并收集細(xì)胞沉淀至1.5 ml離心管內(nèi)，1×PBS洗1次，加1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。離心，吸取固定液，1×PBS洗3次。離心，棄PBS，加1 ml染色工作液，37℃孵育過夜。取染色后的細(xì)胞，觀察并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 5.0處理。結(jié)果以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 載體構(gòu)建

我們構(gòu)建了分別表達(dá) Venus、Gas2、Gas2Δ171-313、Gas2Δ1-170的各類慢病毒載體，目的基因由SFFV(spleen focus forming virus)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)(圖1A)?；蛐蛄杏蒁NA測(cè)序驗(yàn)證，Gas2及其變體均能在K562細(xì)胞中成功表達(dá)(圖1B)。

圖1 載體構(gòu)建A.schematic structure of lentiviral vector;B.Western blotting to detect the protein expressionFig 1 Vector construction

2.2 Gas2Δ171-313抑制K562細(xì)胞的增殖

為了測(cè)定Gas2及其變體對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，對(duì)照表達(dá)Gas2及其變體的細(xì)胞在體外培養(yǎng)6 d，并在第3天和第6天分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。如圖2所示:表達(dá) Gas2和 Gas2Δ1-170的 K562細(xì)胞與對(duì)照Venus組相比，生長(zhǎng)無顯著差異;而表達(dá) Gas2Δ171-313的K562細(xì)胞與對(duì)照組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制。

圖2 Gas2不同變體對(duì)K562細(xì)胞增殖能力的影響Fig 2 The effect of different Gas2 mutants on K562 cell proliferation

2.3 Gas2Δ171-313抑制K562細(xì)胞的集落生成

為了測(cè)定Gas2及其變體對(duì)K562體外集落形成能力的影響。我們觀察培養(yǎng)14 d后的集落，Gas2和Gas2Δ1-170形成的集落數(shù)目與對(duì)照Venus組無顯著差異，而Gas2Δ171-313組形成的集落數(shù)目較對(duì)照組顯著減少(圖3)。

圖3 Gas2不同變體對(duì)K562細(xì)胞集落生成能力的影響Fig 3 The effect of different Gas2 mutants on colony-forming assay on K562

2.4 Gas2Δ171-313增加Calpain活性

已有研究表明，Gas2Δ171-314通過與 Gas2和Calpastatin競(jìng)爭(zhēng)性抑制Calpain，從而解除Gas2和內(nèi)源性抑制劑 calpastatin對(duì) Calpain的抑制作用，提高Calpain活性，從而抑制細(xì)胞的增殖［14］。我們分別提取對(duì)照組和全長(zhǎng)及變體Gas2表達(dá)細(xì)胞的蛋白樣本，并進(jìn)行Calpain活性的檢測(cè)。結(jié)果顯示，全長(zhǎng)Gas2、Gas2Δ1-170與對(duì)照Venus組中Calpain活性無顯著差異;而Gas2Δ171-313與對(duì)照組相比，其Calpain活性顯著提高(圖4)。

圖4 Gas2及不同變體對(duì)Calpain活性影響Fig 4 The impact of different Gas2 mutants on the calpain activity

2.5 Gas2Δ171-313不影響K562細(xì)胞周期和凋亡

為研究Gas2Δ171-313通過何種機(jī)制抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng)，我們首先進(jìn)行了細(xì)胞周期和凋亡的檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。Gas2、Gas2Δ1-170組與對(duì)照Venus組相比，細(xì)胞周期的分布沒有發(fā)生顯著變化;Gas2Δ171-313有阻滯細(xì)胞在S和G2/M期的趨勢(shì)，但其作用并不顯著(P＞0.05)。Gas2及其變體作用后也沒有顯著增多的亞G0/G1期細(xì)胞，表明Gas2Δ171-313抑制細(xì)胞生長(zhǎng)也不是通過誘發(fā)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的。

2.6 Gas2Δ171-313誘導(dǎo)K562細(xì)胞衰老

為了進(jìn)一步探索Gas2Δ171-313抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，我們進(jìn)行了β-半乳糖苷酶染色。結(jié)果顯示，與對(duì)照Venus組相比，Gas2Δ171-313組陽性細(xì)胞比例明顯增多，達(dá)到(75.27±0.03)%;而 Gas2和Gas2Δ1-170組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為(17.41±0.02)%、(14.01±0.02)%和(9.95±0.03)%。見圖6。結(jié)果提示，Gas2Δ171-313可能通過促進(jìn)K562細(xì)胞衰老而抑制增殖。

圖6 Gas2及不同變體對(duì)K562細(xì)胞衰老影響Fig 6 The impact of different Gas2 mutants on the senescence on K562

2.7 Gas2Δ171-313與Imatinib協(xié)同抑制K562細(xì)胞集落生成

為研究Gas2Δ171-313能否與IM協(xié)同性地抑制K562生長(zhǎng)。我們?cè)贗M存在或不存在的條件下進(jìn)行了集落生成實(shí)驗(yàn)。如圖7所示，當(dāng)加入IM(1 μmol·L-1和5 μmol·L-1)后，Gas2Δ171-313 組相對(duì)于未加入IM細(xì)胞的集落存活能力［分別為(4.65±2.41)%和未檢出］較對(duì)照Venus組［分別為(40.16±3.73)%和(0.49±0.29)%］有顯著下降，表明Gas2Δ171-313可以與IM協(xié)同性地抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖7 IM與Gas2Δ171-313對(duì)K562細(xì)胞集落存活的影響Fig 7 Effect of IM and Gas2Δ171-313 on the survival of K562 colonies

3 討 論

Gas2在CML患者中較正常供體高表達(dá)［9-12］，然而其生物學(xué)意義卻并不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)，僅Gas2Δ171-313對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，而全長(zhǎng)Gas2和Gas2Δ1-170相比對(duì)照組對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)影響沒有明顯差異。Gas2Δ171-313對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制與其增強(qiáng)Calpain的活性相關(guān);Gas2Δ1-170并不能抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng)，表明在K562中Gas2并不與微管系統(tǒng)結(jié)合而阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程;全長(zhǎng)Gas2既不影響細(xì)胞的增殖也不抑制Calpain，我們推測(cè)細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性抑制劑已經(jīng)飽和地結(jié)合了Calpain并有效地抑制了Calpain的活性，因而過表達(dá)Gas2不再顯現(xiàn)出抑制作用。因此，我們認(rèn)為，Gas2在CML細(xì)胞中主要通過結(jié)合并抑制Calpain發(fā)揮其生物學(xué)功能，而并不通過結(jié)合微管阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，這為理解Gas2在CML中異常表達(dá)的生物學(xué)意義提供了有益的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

通過細(xì)胞周期分析，我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照Venus組細(xì)胞相比過表達(dá)Gas2和它的兩個(gè)變體并不能顯著地影響細(xì)胞周期的分布;而Gas2Δ171-313也沒有顯著地誘發(fā)細(xì)胞凋亡，說明Gas2Δ171-313也不通過誘導(dǎo)凋亡而抑制細(xì)胞增殖。

β-半乳糖苷酶活性增強(qiáng)是細(xì)胞衰老的典型分子標(biāo)志。我們發(fā)現(xiàn)，Gas2Δ171-313明顯增強(qiáng)K562細(xì)胞的β-半乳糖苷酶活性，而全長(zhǎng)Gas2和Gas2Δ1-170并不能顯著改變其活性，提示Gas2Δ171-313可能通過誘發(fā)K562細(xì)胞衰老而抑制其增殖。在未來的研究中Gas2Δ171-313如何促進(jìn)K562細(xì)胞衰老值得關(guān)注。

在發(fā)現(xiàn)Gas2Δ171-313能抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng)后，我們也研究Gas2Δ171-313能否與酪氨酸激酶抑制劑IM協(xié)同性地抑制K562。結(jié)果顯示，Gas2Δ171-313能夠與IM協(xié)同抑制K562的集落生成能力，提高K562細(xì)胞對(duì)IM的反應(yīng)敏感性。這有望為更有效地治療CML提供新思路。

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