劉中原，劉 石，徐衛(wèi)松，陳雅君，張莉娟，魏戰(zhàn)勇

(1.河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002;2.河南農業(yè)職業(yè)學院，河南 中牟 451450)

豬偽狂犬病 (PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起多種家畜和野生動物的一種急性傳染?。?］。感染豬偽狂犬病毒的豬臨床癥狀表現(xiàn)為體溫升高，新生仔豬主要表現(xiàn)為神經癥狀，豬偽狂犬病一年四季均可發(fā)生，但以冬春兩季和產仔旺季多發(fā)，往往在分娩高峰時的母豬舍先發(fā)病，而且?guī)缀趺扛C都發(fā)病，發(fā)病率可達100%。近一兩年來PRV的持續(xù)性感染和潛在的免疫抑制，給豬的疾病防治工作帶來了很大的困難，并且給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失。

目前對該病的藥物治療效果不佳，采用疫苗接種是預防該病的主要措施。當前市場上出售的豬偽狂犬疫苗質量參差不齊，對豬群的保護力也千差萬別，大部分養(yǎng)殖戶對疫苗的含毒量不甚了解就盲目的選用疫苗進行免疫預防，結果導致豬群體抗體水平不高，達不到有效的免疫保護力。2012年初，新鄭某豬場發(fā)生豬偽狂犬病，起初并沒有懷疑疫苗，對健康豬群緊急免疫豬偽狂犬疫苗之后，也沒有控制住病情。該場經理就懷疑豬偽狂犬疫苗含毒量低，免疫豬群之后達不到有效的免疫力。鑒于市場出售的豬偽狂犬疫苗含毒量的不同，為給養(yǎng)殖戶們選擇疫苗提供參考依據，根據普通PCR技術［2-3］，建立起了對豬偽狂犬疫苗含毒量進行鑒定的方法，通過此方法旨在找出含毒量較高的豬偽狂犬疫苗進行免疫預防，從而提高豬群免疫成功率，達到降低經濟損失的目的。

1 材料與方法

1.1 疫苗

從市場上購買3種不同廠家生產的豬偽狂犬疫苗，分別標記為1號、2號、3號。其中1號豬偽狂犬疫苗含毒量是20頭份，2號豬偽狂犬疫苗含毒量是10頭份的，3號豬偽狂犬疫苗含毒量是20頭份的。

1.2 引物設計

根據GenBank上公布的豬偽狂犬病毒基因保守序列gh片段上的基因，運用引物設計軟件Primer5.0設計一對針對豬偽狂犬病毒的gh片段的引物。

上游引物序列為 5'-GCGTGTACTGCGAC TGCGTGTT-3'，下游引物序列為 5'-CGA CCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3'。擴增片段大小為355 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 主要試劑以及儀器

DNA Marker DL2000大連寶生物工程有限公司生產;Protein K(美國 Amresco);SIGMA臺式高速低溫離心機;美國ALPHA INNOTECH紫外凝膠成像儀;PCR儀 (PTC-200型)MJ RESESRCH品牌。瑞興科技有限公司生產的 SDS消化緩沖液、Tris飽和酚、苯酚/氯仿/異戊醇;瓊脂糖購自北京美萊博醫(yī)學科技有限公司;其他試劑均為國產分析純產品。3K30型冷凍離心機 (sigma);微量加樣器 (Eppendorf;S2-93自動雙重純水蒸餾器 (上海);DYY-111-6B型電泳儀 (北京六一儀器廠);DYCP-31B型電泳槽 (北京六一儀器廠);凝膠圖像分析系統(tǒng) (Alpha Innotech);UNICO UV-2102可見紫外分光光度計 (Alpha Innotech)。

1.4 疫苗的稀釋

將標記過的1號、2號、3號豬用偽狂犬疫苗用生理鹽水稀釋為每毫升含1頭份豬偽狂犬疫苗毒。取稀釋好的豬偽狂犬1號疫苗1 mL移入高壓過的1.5 mL EP管內，在此EP管中取100 μL移入到新EP管內，加入900 μL滅菌生理鹽水混勻后即成10倍稀釋物，在10倍稀釋物的 EP管中取100 μL移入到新 EP管內，加入900 μL滅菌生理鹽水混勻后即成100倍稀釋物，在100倍稀釋物的EP管中取100 μL移入到新 EP管內，加入900 μL滅菌生理鹽水混勻后即成1 000倍稀釋物。采用同樣的方法將2號、3號豬偽狂犬疫苗用生理鹽水做10倍、100倍、1 000倍的稀釋。

1.5 常規(guī)方法提取疫苗病毒DNA

將上述稀釋好的豬偽狂犬疫苗采用蛋白酶K的方法提取病毒 DNA。具體方法是，將疫苗樣品用離心機8 000 r·min-1離心 3 min。取樣品上清400 μL，加入 400 μL 的 SDS消化緩沖液，7 μL 的蛋白K，55℃消化1.5 h。樣品消化完全之后加入350 μL的Tris飽和酚，然后用離心機8 000 r·min-1離心3 min。再吸取上清移入新的1.5 mL的EP管內，加入比例為 25∶24∶1的酚-氯仿-異戊醇 350 μL，然后用離心機8 000 r·min-1離心3 min。再吸取上清移入新的1.5 mL的 EP管內，加入氯仿-異戊醇350 μL，8 000 r·min-1離心 3 min。用移液槍吸取離心好的上清移入到新的 EP管內，加入氯仿350 μL，再8 000 r·min-1離心 3 min。吸取離心好的上清加入新的EP管內，再加入等體積的異丙醇，放入-20℃冰箱內沉淀40 min。異丙醇沉淀40 min之后，放入離心機內8 000 r·min-1離心3 min，棄去上清。再加入70%的乙醇350 μL放入離心機內8 000 r·min-1離心3 min洗去其他雜質，重復洗滌1次，棄去上清之后，再放入離心機內8 000 r·min-1離心1 min。取出樣品，放在 EP管架上，自然干燥30 min之后加入20 μL的三蒸水洗脫DNA?？梢灾苯赢斪瞿０鍼CR反應，也可以放在-20℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR擴增

采用的PCR反應體系是25 μL反應體系，體系組份如下:每一個反應管中加2倍PCR Taq Mix 8 μL(組 成 為 400 μmol dNTP each;0.2 U Taq DNA Poly-merase·μL-1;100 mmol KCl;20 mmol Tris-HCl;3 mmol MgCl2);豬偽狂犬病毒gh基因上、下游引物 (引物濃度為20 pmol·μL-1)每一個反應管中分別為1 μL，提取的DNA作為PCR反應體系中的模板，每一個反應管中加2 μL，最后每一個反應管中補加高壓過的雙蒸水13 μL。按照優(yōu)化過后的豬偽狂犬病毒gh基因片段的程序進行擴增:95℃變性10 min，94℃ 45 S，退火溫度54℃ 30 S，72℃ 1 min，共30個循環(huán)，然后72℃延伸10 min，4℃保持10 min。PCR程序反應結束之后，取5 μL PCR擴增得到的產物，進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外凝膠成像儀照相，記錄實驗結果。

2 結果和分析

2.1 對豬偽狂犬疫苗毒稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

參考一些 PCR檢測［4-6］的方法，將樣品進行1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32 和 1∶102 4的倍比稀釋進行PCR擴增，瓊脂糖電泳結果顯示幾種稀釋倍數(shù)之間的擴增結果差異不顯著，而且耗時、費力。經過稀釋倍數(shù)條件優(yōu)化得到 1∶10倍、1∶100倍、1∶1 000倍的稀釋能達到較好的試驗結果，并且節(jié)省了大量的時間和金錢。

2.2 對PCR反應體系的優(yōu)化

對PCR反應體系進行了優(yōu)化，結果2倍PCR Taq Mix 8 μL;上、下游引物 1 μL;模版 2 μL;ddH2O 13 μL;PCR擴增程序優(yōu)化為 95℃變性10 min，94℃ 45 S，退火溫度54℃ 30 S，72℃1 min，共30個循環(huán)，然后72℃延伸10 min，4℃保持10 min。

2.3 對豬偽狂犬病毒疫苗PCR擴增電泳的檢測

對每一種豬偽狂犬病毒疫苗稀釋為4管，提取DNA進行PCR擴增之后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示。1號豬偽狂犬疫苗10倍稀釋之后電泳條帶就不太亮了，100倍稀釋之后就沒有電泳條帶了，說明1號豬偽狂犬疫苗的抗原含量低，若用于臨床上豬群的免疫預防很可能起不到良好的免疫保護力。而從市場購買的2號豬偽狂犬疫苗在稀釋1 000倍之后還能夠隱約看到電泳條帶，說明其抗原含量高，若采用抗體效價的表示方法來計算其含毒量的話，疫苗含毒量高達210可以應用于豬群的免疫預防。同樣的道理，3號豬偽狂犬疫苗含毒量約27，免疫豬群之后也能產生較好的免疫力。

圖1 1-3號豬偽狂犬疫苗PCR擴增結果

3 小結和討論

從2011年至今豬偽狂犬病在我國部分地區(qū)接連不斷的發(fā)生，給我國養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經濟損失。有些養(yǎng)殖戶開始懷疑市場上出售的豬偽狂犬疫苗抗原效價不高，達不到理想的免疫保護力，他們急需知道自己所使用的豬偽狂犬疫苗質量的好壞。有報道［7］稱，進口的豬偽狂犬疫苗引發(fā)了偽狂犬病的流行，那么我國當前市場的豬偽狂犬疫苗含毒量能不能有效的保護豬群的健康，不僅是每一個養(yǎng)殖戶想知道的，對于我們科研工作者也是想迫切知道的。陳偉杰等［8］比較了三種 ELISA試劑盒對豬偽狂犬病gE抗體的檢測效果，羅飛等［9］建立了血清中豬偽狂犬gB抗體的ELISA檢測方法，由此可見利用ELISA技術檢測抗體效價的技術比較成熟。而利用ELISA技術檢測豬偽狂犬病毒抗原的報道很少，從疫苗中檢測抗原的含量來評價疫苗的相關文獻在國內就更少見了。

本試驗根據抗體效價檢測的一般原理，采用疫苗抗原倍比稀釋的方法對市場上出售的豬偽狂犬疫苗進行PCR檢測，使抗原檢測與PCR技術得到了完美的結合，得到了較好的實驗結果，能夠為臨床上選用豬偽狂犬疫苗提供參考。也可以采用此方法對市場上出售的其他疫苗進行含毒量的檢測，為臨床的使用提供參考依據。

筆者建立的利用PCR技術檢測疫苗抗原的方法，能夠省去繁重的勞動強度、節(jié)省大量的時間和經濟成本，為疫苗抗原檢測提供了一條新的思路。

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