范傳潁，陶正明，，吳志剛

(1.溫州醫(yī)學(xué)院，浙江溫州 325035;2.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江溫州 325005)

鐵皮石斛 (Dendrobium officinale)是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺止咳等功效，常用于熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱等多種病癥［1］。鐵皮石斛含有多糖、生物堿、萜類、揮發(fā)油、氨基酸、微量元素等多種化學(xué)成分。現(xiàn)代藥理研究證明［2-4］，多糖具有增強(qiáng)免疫和抗腫瘤作用，鐵皮石斛多糖含量較高，而被認(rèn)為是其藥用的主要有效成分。

多糖含量測定的方法有很多。一類是利用多糖的還原性，如3，5-二硝基水楊酸鹽比色法和Somogyi-Nelson法;另一類是普遍使用的利用多糖在強(qiáng)酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，再與酚類或胺類化合物縮合，生成有特殊顏色的物質(zhì)這一性質(zhì)進(jìn)行測定，如苯酚-硫酸法和蒽酮硫酸法。本文在已有的研究基礎(chǔ)上［5］，對苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法測定多糖含量進(jìn)行了比較，為確定合理的鐵皮石斛多糖含量測定方法提供依據(jù)。

1 材料與儀器試劑

鐵皮石斛由浙江雁蕩千山鐵皮石斛種植基地提供。

島津-2550型紫外可見分光光度計(jì) (日本島津公司);Milli-Q A10型純水儀 (美國Millipore公司);Mettler Toledo AL204型電子天平 (瑞士);KQ500型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);DZF-6050型真空干燥箱 (上海恒一科學(xué)儀器有限公司);HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 (金壇市江南儀器廠)。

石油醚 (60～90℃)、乙醇、苯酚、濃硫酸、蒽酮均為分析純，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 (分析純，用前105℃烘2 h)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鐵皮石斛多糖的提取與精制

稱取鐵皮石斛粉末25.0 g，置圓底燒瓶中，加入石油醚150 mL，回流提取1 h(去脂)，過濾，揮干溶媒。濾渣用80%乙醇150 mL回流提取1 h，過濾，揮干溶媒。濾渣用200，150，150 mL蒸餾水依次回流提取，每次1 h，過濾，合并濾液，濃縮至150 mL，與等體積 sevag試劑 (正丁醇∶氯仿為4∶1)萃取多次，取上清液，緩慢加入乙醇，使溶液含乙醇80%，在滴加過程中用磁力攪拌器攪拌，靜置過夜。過濾，沉淀用無水乙醇、丙酮清洗多次。沉淀置60℃真空干燥箱干燥，得鐵皮石斛精制多糖，封裝備用。

2.2 樣品制備及試劑配制

樣品制備。鐵皮石斛莖干燥后粉碎，取0.25 g粉末置圓底燒瓶中，加入石油醚50 mL，脫脂30 min，趁熱過濾，揮干溶媒。濾渣用80%乙醇回流提取1 h，趁熱過濾，濾渣用80%乙醇充分洗滌，再次揮干溶媒。殘?jiān)?0 mL蒸餾水回流提1 h，過濾，再用35 mL蒸餾水回流提1 h，過濾，用少許熱水洗滌藥渣和燒瓶，合并濾液，冷卻后在100 mL容量瓶中定容，得樣品溶液。

對照品溶液的制備。精密稱取無水葡萄糖100 mg加蒸餾水定容至100 mL，搖勻，得1 mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液。

5%苯酚溶液的制備。精密稱取5 g苯酚，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻后，放置在棕色瓶中。

蒽酮硫酸溶液的制備。精密稱取蒽酮0.1 g，加80%的硫酸溶液100 mL使溶解，搖勻，放置于棕色瓶中。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及換算因子

2.3.1 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密量取1 mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL置100 mL容量瓶中，各加蒸餾水至刻度。精密量取上述各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液2.0 mL于10 mL具塞試管中，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，再精密加濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置5 min，置90℃水浴中加熱15 min，取出，室溫放置冷卻，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，在490 nm的波長處測定吸光度，得到回歸方程y=0.061 1x-0.024 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。表明葡萄糖濃度在2.5～15.0 μg·mL-1范圍與吸光度有良好的線性關(guān)系。

圖1 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密吸取1 mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0 mL 置 100 mL 容量瓶中，各加蒸餾水至刻度。精密量取上述各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液2.0 mL于10 mL具塞試管中，精密加入蒽酮硫酸溶液6.0 mL，置水浴加熱15 min，取出，放入冷水中冷卻15 min，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，測定625 nm處吸光度。得到回歸方程y=0.010 9x+0.082 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0。表明葡萄糖濃度在5～30 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

圖2 蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3 換算因子

精密稱取60℃干燥至恒重的鐵皮石斛多糖10 mg，配制成0.04 mg·mL-1溶液。取2.0 mL按苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，測定吸收度，從回歸方程中求得供試液中葡萄糖的質(zhì)量，按F=W/C計(jì)算換算因子。式中:W為實(shí)際多糖質(zhì)量，C為測得的多糖溶液中葡萄糖的質(zhì)量。計(jì)算結(jié)果為F=1.249。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度

取供試液按上述方法操作，連續(xù)測定6次，相對標(biāo)準(zhǔn)差0.46%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性

取供試液分別按照苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的操作，測定反應(yīng)結(jié)束后0，20，40，60，90，120 min時的吸光值。結(jié)果苯酚-硫酸法測得相對標(biāo)準(zhǔn)差為2.30%，蒽酮-硫酸法測得相對標(biāo)準(zhǔn)差為1.28%。

2.4.3 重現(xiàn)性

為考察方法的重現(xiàn)性，取同批次鐵皮石斛6份，按照2.2節(jié)方法制備，分別用苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法測定其穩(wěn)定性，結(jié)果測得兩法的相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.88%和2.52%。

2.4.4 回收率

分別稱取已知含量鐵皮石斛粉末各0.25 g，分別精密加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液適量，按樣品制備和含量測定方法進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率 (表1)，考察方法的準(zhǔn)確度。

表1 加樣回收率

2.5 樣品的含量測定

9批鐵皮石斛 (60℃烘干后，粉碎備用)分別取0.25 g，按照2.2節(jié)方法制備樣品溶液。取1 mL樣品溶液置10 mL容量瓶中定至刻度，再從10 mL容量瓶中取1 mL至10 mL試管中，加水至2 mL，按照兩法各自標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，由回歸方程計(jì)算出葡萄糖的質(zhì)量濃度 (表2)。

多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)=(CS·D·V·F)/W。

式中:CS為供試品溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度;D為供試品溶液的稀釋倍數(shù);F為多糖的換算因數(shù);V為供試品溶液的體積;W為樣品質(zhì)量。

對表中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果P＞0.1，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不能認(rèn)為兩者的方差不等，因此可采用方差相等的配對t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果t=2.019，查t表得P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為兩種方法測定鐵皮石斛多糖含量的結(jié)果不同，蒽酮-硫酸法測定結(jié)果偏高。

表2 樣品的含量測定

3 小結(jié)與討論

從方法學(xué)考察結(jié)果看，兩種測定方法均有精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好及操作簡單等特點(diǎn)，理論上均具有可行性。

苯酚-硫酸法測定時需注意兩點(diǎn):一是苯酚易氧化，要用重蒸酚;二是反應(yīng)過程劇烈，應(yīng)避免不必要的傷害。蒽酮-硫酸法測定時，蒽酮硫酸需現(xiàn)用現(xiàn)配，相比苯酚硫酸法，反應(yīng)過程較溫和。

苯酚-硫酸法是常用測定多糖含量的方法，可用于甲基化糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單、靈敏度高，試驗(yàn)時基本不受蛋白質(zhì)存在的影響。蒽酮-硫酸法幾乎可以測定所有的碳水化合物，所以用該法測出的多糖含量，實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。因此，蒽酮-硫酸法測定結(jié)果偏高于苯酚-硫酸法。兩種方法相比，苯酚-硫酸法測定更為合理準(zhǔn)確，因此可作為鐵皮石斛多糖測定的首選方法。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010版1部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:266.

［2］ 羅慧玲，蔡體育，陳巧倫，等.石斛多糖增強(qiáng)臍帶血和腫瘤病人外周血LAK細(xì)胞體外殺傷作用的研究［J］.癌癥，2000，19(12):1124-1126.

［3］ 張紅玉，戴關(guān)海，馬翠，等.鐵皮石斛多糖對S180肉瘤小鼠免疫調(diào)節(jié)功能的影響 ［J］.浙江中醫(yī)雜志，2009，44(5):380.

［4］ 李欽，陳愛君，張信岳.鐵皮石斛顆粒增強(qiáng)免疫功能作用研究 ［J］.中藥藥理與臨床，2008，24(1):53.

［5］ 劉曉涵，陳永剛，林勵，等.蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測定枸杞子中多糖含量的比較 ［J］.食品科技，2009，34(9):270-272.