蔡宏浩, 崔曉紅, 林美金, 陳 忠

(1. 廈門大學 電子科學系 福建省等離子體與磁共振研究重點實驗室, 福建 廈門 361005; 2. 廈門大學 海洋學系 近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室, 福建 廈門 361005)

核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)以其精確性、選擇性和無創(chuàng)性成為最有用和最普遍的譜學分析方法之一。從復雜的生物分子到各種材料, 從活的有機體到納米分子, NMR譜提供了許多寶貴的信息。魚肉和魚卵富含動物蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和磷脂質(zhì)等物質(zhì), 易被人體消化吸收, 對人類體力和智力的發(fā)展具有重大作用, 因此對經(jīng)濟魚類和模式魚類的研究對人類有著重大的意義。然而, 迄今人們對不同魚類的營養(yǎng)價值差異, 魚類的生存條件等因素對其生長、繁殖的影響以及魚類藥物測試等方面的研究尚處于起步階段, 而NMR技術(shù)正是研究這些課題的有力手段。

對于液體樣品, 利用液體NMR譜方法能夠獲得具有化學位移、J偶合常數(shù)等譜信息的高分辨NMR譜圖。魚類雖然含有較多水分, 但是仍屬于固體, 固體NMR譜圖中譜峰的線寬往往比液體要寬的多, 譜圖分辨率很低。如果用小動物磁共振成像儀(magnetic resonance imaging, MRI)對整只魚采集1H NMR譜圖, 樣品內(nèi)部固有的不均勻性將導致譜線的嚴重增寬。因此如何獲得魚類的高分辨NMR譜對魚類的深入研究具有重大的意義。當前獲取魚類NMR高分辨譜主要有3種方法: 萃取物高分辨NMR譜方法, 魔角旋轉(zhuǎn)法(magic angle spin, MAS)以及基于分子間多量子相干(intermolecular multiple-quantum coherences, iMQC)的NMR方法。萃取物高分辨NMR譜方法是魚類和魚卵研究中最早出現(xiàn)也是目前最常用的NMR方法。該方法的優(yōu)點是: 譜圖分辨率高, 利于譜峰的歸屬, 利用基于自旋回波采樣技術(shù)的NMR方法還能夠獲得魚肉中除大分子脂質(zhì)外的小分子化合物的譜信息。而該方法的缺點在于對組織的破壞性大, 難以進行原位、在體、無損的研究。隨著NMR硬件技術(shù)的進步, Varian Nano 探頭[1]的出現(xiàn), 魔角旋轉(zhuǎn)法能夠有效平均固體樣品中核自旋間的偶極-偶極相互作用, 窄化譜峰線寬, 成為人們獲取生物組織高分辨NMR譜的另一有力手段。MAS方法的優(yōu)點在于無需對樣品進行復雜的萃取操作過程, 對組織的破壞性較小; 而缺點同樣在于無法進行原位、在體、無損的研究。除了NMR硬件上的改進外, 還可以通過設計脈沖序列和數(shù)據(jù)處理方法在不均勻不穩(wěn)定場下獲取高分辨譜。近年來發(fā)展的基于分子間多量子相干的NMR方法, 由于其對磁場不均勻性不敏感的特性, 因而能有效減小NMR譜線的線寬, 從而獲得高分辨譜圖。iMQC的作用范圍與偶極相干距離dC相關(guān),dC的范圍在5 ～ 500 μm, 一般遠小于實驗樣品的尺寸, 當dC比磁場的不均勻度還小時就有可能獲得線寬很窄的譜線, 從而消除或減弱磁場不均勻?qū)MR譜圖分辨率的影響。更重要的是, iMQC能夠獲得與常規(guī)單量子相干(single-quantunm coherences, SQC)類似的化學位移、J偶合常數(shù)等譜信息。但是由于iMQC的信號強度只有常規(guī)SQC信號的1/10, 因此信噪比較低。隨著磁場強度的提高, 超低溫探頭以及磁化轉(zhuǎn)移技術(shù)的應用, 這個問題將會逐步得到改善。

作者將評述獲取魚類及魚卵高分辨NMR譜的方法及其在魚類研究中的應用現(xiàn)狀。

1 萃取物高分辨NMR譜方法

1.1 基本原理

萃取物高分辨NMR譜方法就是從魚肉或者魚卵中萃取脂類, 酸類等物質(zhì), 然后進行NMR檢測以獲取高分辨NMR譜圖的方法。通過對魚肉或魚卵的萃取物進行NMR檢測, 能夠獲得魚肉內(nèi)脂類和酸類物質(zhì)的詳細譜學信息, 從而確定各種小分子代謝物和大分子代謝物的結(jié)構(gòu)和含量, 甚至一些含量很低的物質(zhì)如游離氨基酸、核苷酸、縮氨酸等也能夠檢測到。目前, 萃取魚肉或魚卵的方法中比較常用的是布萊戴爾(Bligh and Dyer)法[2]。萃取后, 一般在萃取物中加入適量的氘代試劑, 目的是為了進行鎖場[3]。

常見的NMR譜有氫(1H)、碳(13C)、磷(31P)譜[4]等, 分別是利用物質(zhì)中所含有的1H、13C和31P元素來進行檢測。1H是NMR檢測方法中旋磁比最大的元素, 在自然界天然豐度也非常高, 因此1H NMR譜的靈敏度最高, 但由于魚肉和魚卵含有的脂類, 酸類及蛋白質(zhì)等都是結(jié)構(gòu)復雜的化合物, 而1H NMR譜本身的譜寬一般在10(10-6)以內(nèi), 因此往往會造成譜峰的重疊。而13C NMR譜的譜寬可以達到250 (10-6), 譜峰不易重疊, 分辨率較高, 然而, 由于13C的旋磁比只有1H的1/4, 且天然豐度僅為1.1%, 因此13C的靈敏度只有1H的1/6000, 故13C NMR譜實驗需要長時間累加。1H NMR譜和13C NMR譜各有各的優(yōu)勢, 在實際使用中可以按實驗的目的和要求進行選擇。

1.2 典型例

Gribbestad[5]在布魯克DRX 500 MHz譜儀上采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)[6]脈沖序列對從大西洋鮭魚白肉萃取得來的脂類和酸類物質(zhì)分別進行NMR實驗, 得到的脂類和酸類物質(zhì)的1H NMR譜分別如圖1和圖2所示, 對譜峰的歸屬分別如表1和表2所示。根據(jù)圖1和表1, 作者對不同類型的n-3脂肪酸和DHA進行了歸屬, 結(jié)合13C NMR譜和氣相色譜(gas chromatography, GC)確定了不同脂肪酸的結(jié)構(gòu)和含量。由圖2和表2對酸類的1H NMR譜進行了歸屬, 包含乳酸、肌酸、鵝肌肽和氨基酸等, 其中乳酸峰有很好的分辨率, 可以用于對組織中所含的乳酸進行定量分析。

Falch等[7]在布魯克DRX 600 MHz譜儀上獲得的鱈魚(Gadous macrocephalus)卵及鱈魚精子的13C NMR譜如圖3所示。通過得到的13C NMR譜, 作者分析了膽固醇在鱈魚精子和卵子的發(fā)育過程中的變化, 并對魚精子和卵子進行了分級。

圖1 500 MHz譜儀大西洋鮭魚(Salmo salar L.) 白肉脂類提取物的1H NMR譜 (文獻[5])

表1 大西洋鮭魚白肉脂類提取物的1H NMR譜譜峰歸屬(文獻[5] )

圖2 500 MHz譜儀大西洋鮭魚白肉酸類提取物的1H NMR譜(文獻[5])

表2 大西洋鮭魚白肉酸類提取物的1H NMR譜峰歸屬(文獻[5])

2 魔角旋轉(zhuǎn)法

2.1 基本原理

由于固體中存在各種各向異性的相互作用, 因此, 固體NMR譜峰線寬往往比液體譜峰線寬寬的多。最明顯的例子是水, 液態(tài)水中質(zhì)子的NMR線寬可達到0.1 Hz, 然而在冰中則達到105 Hz。研究發(fā)現(xiàn), 通過對固態(tài)樣品中的原子核施加某些操作使其產(chǎn)生運動, 可以觀測到NMR線寬有效窄化。MAS方法就是使樣品在以其與外加恒定磁場方向的夾角的軸上作快速旋轉(zhuǎn), 當旋轉(zhuǎn)速度滿足一定的條件時所觀測到的固體NMR譜峰線寬明顯縮窄[8]。

進行MAS實驗獲得的譜峰線寬與魔角設置的準確度和轉(zhuǎn)速有很大關(guān)系, 通常要獲得高分辨譜圖, MAS實驗要求轉(zhuǎn)速足夠高、足夠準, 魔角設定足夠準、足夠穩(wěn)。此外, 由于13C NMR譜靈敏度很低, 因此MAS實驗最佳選擇是1H NMR譜。

2.2 典型例

Bankefors等[9]在布魯克Avance 600 MHz譜儀上分別將MAS技術(shù)與3種脈沖序列相結(jié)合對大西洋鮭魚進行實驗, 實驗對象是大西洋鮭魚肉組織, 獲得的一維(one-dimensioanl, 1D)1H MAS NMR譜如圖4所示。圖4a和圖4b同時顯示了包含小分子代謝物和大分子代謝物如脂肪酸和糖原的譜峰, 而圖4c則過濾了小分子代謝物只剩下大分子代謝物, 這樣便有可能區(qū)分組織中的小分子代謝物和大分子代謝物。

與萃取法相比, 魔角旋轉(zhuǎn)法能夠?qū)⑼暾粔K魚肉放進譜儀檢測, 不僅省去了萃取的步驟, 而且對組織破壞較小, 所需樣品量少。缺點是需要更換專用的Nano探頭進行實驗, 增加了設置魔角等操作步驟。而與組織魔角旋轉(zhuǎn)NMR譜相比, 萃取物高分辨NMR譜靈敏度更高。

3 基于分子間多量子相干的NMR方法

3.1 基本原理

圖3 500 MHz譜儀鱈魚卵(A)及鱈魚精子(B)的13C NMR譜(文獻[7])

圖4 600 MHz譜儀魔角旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速4 kHz下5 mg大西洋鮭魚肉1H NMR譜

iMQC來自分子間的遠程偶極相互作用, 當偶極相干距離比磁場的不均勻度還要小時就有可能在不均勻磁場下獲得線寬窄化的譜圖。分子間偶極相互作用的有效范圍為5 ～ 500 μm, 遠小于一般樣品的尺寸, 在偶極相干距離內(nèi)磁場基本可以看成是均勻的, 因此, 可以將iMQC方法應用于不均勻場獲得高分辨率譜圖。與萃取法和魔角旋轉(zhuǎn)法相比, iMQC方法最大的優(yōu)勢就是能夠保持樣品的完好性, 能進行原位、在體檢測, 省去了萃取, 更換探頭以及設置魔角的步驟, 極大地簡便了實驗過程。將iMQC方法與定域譜[10]技術(shù)結(jié)合可以靈活地對生物體(如魚等)的指定區(qū)域進行原位、在體、無損的檢測。

3.2 典型例

廈門大學陳忠小組[11]2009年提出了基于分子間雙量子相干(intelmolecular double-quantum coherence, iDQC)的iDQF-HOMOGENIZED II(簡稱iDH2)一系列序列: iDH2-2J、iDH2-1J、和iDH2-0J, 如圖5所示。并以跳跳魚(Boleophthalmus pectinirostris)為實驗對象, 將其麻醉后不做處理直接放入核磁管, 應用iDH2序列進行NMR實驗, 并與經(jīng)典的PRESS定域譜方法和魔角旋轉(zhuǎn)法做了對比, 實驗結(jié)果如圖6所示。

圖5 iDH2系列序列圖

圖6 500 MHz譜儀完整跳跳魚的矢狀面和冠狀面微成像和1H NMR譜

從圖6可以看到, e圖的常規(guī)PRESS譜由于跳跳魚固有的不均勻性導致獲得的譜圖線寬較寬, 分辨 率低。而iDH2序列能夠克服跳跳魚固有的不均勻性, 可以獲得與魔角旋轉(zhuǎn)法相近分辨率的高分辨譜圖, 并且真正做到原位、無損檢測。iMQC方法的缺點在于靈敏度較低, 只有常規(guī)實驗的1/10。

4 核磁共振技術(shù)的應用

4.1 海產(chǎn)等級區(qū)分

魚類和貝類既是美味的又是極富營養(yǎng)價值的食物, 尤其是深海魚體內(nèi)的不飽和脂肪酸, 如: EPA、DHA等, 有助于調(diào)節(jié)血脂、改善視力、提高記憶力、預防老年癡呆。魚卵中含有豐富的磷脂質(zhì), 而磷脂質(zhì)中的n-3不飽和脂肪酸對人類的健康非常有益[12], 能夠預防心血管疾病[13], 對大腦及神經(jīng)系統(tǒng)都有正面的影響, 并能夠提高人體免疫力[14]。拿三文魚(Salmo)舉例, 脂類含量的多少和三文魚品質(zhì)有很大的關(guān)系, 脂類多的三文魚無論在口感還是營養(yǎng)價值方面都更好[15]。通過NMR技術(shù)可以定量分析三文魚肉中脂類物質(zhì)的含量, 如圖1所示, 該譜圖給出了不飽和脂肪酸的譜峰歸屬, 峰的強度越高代表該物質(zhì)含量越多。因此, 在同樣條件下對不同魚肉采集NMR譜圖, 便能比較不同魚肉脂類含量的多少。類似地, 利用NMR技術(shù)也能對魚卵含有的不飽和脂肪酸進行譜峰歸屬和定量測量[16]。

同時, 利用NMR技術(shù)還可以追蹤同一條魚或者魚卵在不同時期脂類或者酸類物質(zhì)的變化情況, 以此觀察魚和魚卵的生長發(fā)育情況。Rezzi等[17]便利用NMR方法采集的金頭鯛(Sparus aurata)脂類的NMR譜圖對其進行等級區(qū)分。Tyl等[18]采用NMR方法對4種魚體內(nèi)的脂肪酸的變化做了研究。

4.2 鑒別野生與養(yǎng)殖

通過NMR譜圖能夠區(qū)別魚類是野生還是養(yǎng)殖, 甚至判斷出魚類的原產(chǎn)地。Aursand等[19]通過13C NMR譜圖配合概率神經(jīng)網(wǎng)絡(PNN)[20]和支持向量機(SVM)[21]研究如何區(qū)分野生和養(yǎng)殖三文魚以及三文魚的原產(chǎn)地。挪威養(yǎng)殖三文魚(NF)在化學位移31.48 ppm位置上的脂肪峰強度顯著高于挪威野生三文魚(NW)、蘇格蘭野生三文魚(SW)、愛爾蘭野生三文魚(IW)(圖7)。

Trocino等[22]利用相似的方法對有機養(yǎng)殖和傳統(tǒng)養(yǎng)殖的歐洲海鱸魚(Dicentrarchus labraxL.)進行了實驗, 研究發(fā)現(xiàn)有機養(yǎng)殖的鱸魚體內(nèi)n-3至n-6不飽和脂肪酸的單位含量要比傳統(tǒng)養(yǎng)殖的鱸魚要高。

4.3 生長條件對魚類的影響

養(yǎng)殖魚類的質(zhì)量受許多因素影響, 如水溫、鹽度、含氧量、污染物、飼料等。通過NMR技術(shù)可以定性定量研究這些因素對魚類質(zhì)量的影響, 從而通過優(yōu)化養(yǎng)殖來改善魚類的質(zhì)量。

Bankefors等[9]對喂食普通魚飼料和20%接合菌飼料的大西洋鮭魚進行NMR實驗, 并利用MATLAB[23]工具結(jié)合主成分分析法(principal component analysis, PCA)[24]得到結(jié)果如圖8所示。從得分圖(a)可以看出普通魚飼料喂養(yǎng)的鮭魚和20%接合菌飼料喂養(yǎng)的鮭魚明顯的區(qū)分了開來, 進一步從負載圖(b)可以看出喂食20%接合菌飼料的鮭魚主要在乳酸(Lactate)、鵝肌肽(Anserine)、肌酸(Creatine)這3個成分上與喂食普通飼料的鮭魚產(chǎn)生了區(qū)別。

Viegas等[25]利用一定濃度的氘代水飼養(yǎng)禁食和正常喂食的歐洲海鱸魚一定時間后, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常喂食的鱸魚在葡萄糖代謝物在量上要多于禁食鱸魚。通過這一實驗可以無損的觀測葡萄糖在魚體內(nèi) 的代謝過程。

圖7 500 MHz譜儀三文魚脂類提取物的部分13C NMR譜(化學位移范圍為31.3 ～32 ppm)

當今河流與海洋都受到不同程度的污染, 因此通過模擬污染環(huán)境分析污染物對魚類和貝類的影響對海洋產(chǎn)業(yè)有重要的意義。刑麗紅等[26]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究三聚氰胺在大菱鲆(Scophthalmus maximus)體內(nèi)的代謝規(guī)律, 從而為防范三聚氰胺殘留提供理論依據(jù), 而NMR技術(shù)同樣能夠做到類似的檢測[27], 并能做到原位、無損檢測, 而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法做不到。Zhang等[28]利用NMR技術(shù)以馬尼拉蛤蜊(Manila clam,Ruditapes philippinarum)為實驗對象, 研究不同時間、不同劑量的具有致癌致畸性的苯并(a)芘對蛤蜊的影響, 對蛤蜊的腮提取物采集NMR譜圖, 并應用PCA分析譜圖, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)苯并(a)芘會改變蛤蜊體內(nèi)的某些代謝物的含量。Ekman等[29]以呆鰷魚(Fathead minnow)的尿液為研究對象, 應用NMR技術(shù)結(jié)合PCA方法分析了呆鰷魚暴露在某些化學環(huán)境下體內(nèi)代謝物的變化。

4.4 魚類生產(chǎn)加工

朱榕璧等[30]將NMR技術(shù)應用于魚糜的漂洗、擂潰、凝膠和保藏, 定性定量研究了各種添加劑對魚糜制品的影響。NMR技術(shù)可以快速、準確、無破壞性廣泛應用于魚糜制品加工的各個環(huán)節(jié)中。此外, Gudjonsdottir 等[31]利用NMR技術(shù)測量鮭魚肉的縱向弛豫時間(T1)和橫向弛豫時間(T2), 以此來比較兩種不同的魚肉腌制方法對魚肉中蛋白質(zhì)的影響。

4.5 魚類成像

通過磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)技術(shù)可以無損、在體地獲得魚類的內(nèi)部構(gòu)造圖像, 進而能夠從圖像上觀察得到魚類的發(fā)育情況, 病變等訊息。Nott等[32]在布魯克 BMT 2.35T 動物成像儀上獲得了虹鱒魚(Salmo gairdneri)的磁化轉(zhuǎn)移速率加權(quán)的磁共振成像圖, 由于磁化轉(zhuǎn)移速率隨著蛋白質(zhì)的密度增加而增大, 虹鱒魚的肌肉和內(nèi)臟中的蛋白質(zhì)在冰凍后聚合導致密度增大。因此, 從圖9中可以很明顯地看出: 冰凍后的虹鱒魚橫斷面圖 的強度比新鮮的虹鱒魚的橫斷面的強度要大, 尤其是內(nèi)臟位置, 冰凍后的亮度顯著大于新鮮的。因此, 通過MRI技術(shù)可以區(qū)分新鮮的和冰凍過的虹鱒魚。

圖8 大西洋鮭魚魚肉切片組織的PCA得分圖及負載圖

圖9 2.35T 動物成像儀上同一只虹鱒魚在新鮮(左)和冰凍儲存4周后(右)的磁共振橫斷面圖 (文獻[32])

5 結(jié)語

海洋是生命的搖籃, 蘊藏著極其豐富的資源, 人類對海洋的探索一直沒有停止, 但是海洋還有許多未解之謎。NMR技術(shù)能夠無創(chuàng)、無損、定性、定量地對實驗對象進行檢測, 配合其他數(shù)學工具, 能夠用于研究許多其他技術(shù)不能解決或是較難解決的問題。因此, NMR技術(shù)在挖掘海洋資源, 保護海洋環(huán)境等方面具有潛在的巨大優(yōu)勢。

作者比較分析了3種獲取高分辨NMR譜的方法, 給出了對應的實驗驗證, 并介紹了一些具體應用。萃取法和MAS方法能夠獲得高分辨NMR譜圖, 缺點是這兩種方法都會對實驗對象造成不同程度的損傷?；趇MQC的NMR方法能夠在對生物體不損傷的情況下進行原位、在體檢測。但其缺點是固有的低靈敏度。因此, 如何提高iMQC方法的靈敏度, 如何利用iMQC方法獲得高分辨、高靈敏度的NMR譜是今后研究的重要課題。

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