戰(zhàn)麗莉，王 義，許艷麗，裴希超，劉振宇

(1. 中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所中國科學院黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)院重點實驗室，海倫農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外觀測研究站，黑龍江哈爾濱150081; 2. 黑河學院物理化學系，黑龍江黑河164300; 3.Rutgers University，New Brunswick NJ 08901－8520，USA; 4. 黑河出入境檢驗檢疫局，黑龍江黑河164300;5. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086)

0 引 言

昆蟲病原線蟲(Entomapathgenic Nematoda)是一類專性寄生土壤害蟲的微小動物，屬動物界、線蟲門(Nematoda)、側(cè)尾腺口綱(Secernentea)、圓線蟲目(Rhabditida)，斯氏線蟲科(Steinernematidae)和異小桿線蟲科(Heterhabditidae)。昆蟲病原線蟲由于具備對害蟲致死范圍廣、致死速度快、對人畜以及其它有益生物包括害蟲天敵等無不良影響、對環(huán)境無污染以及易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點，成為害蟲生物防治的重要因子，被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用。昆蟲病原線蟲主要生活在土壤中，具有主動搜尋昆蟲寄主的能力［1］。昆蟲病原線蟲可有效地控制鉆蛀性害蟲，對花生田地下害蟲蠐螬防效可達到95%以上，效果明顯好于辛硫磷的防治效果［2］，試驗對大豆田地下害蟲東北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)的幼蟲進行防治，發(fā)現(xiàn)致死率同樣達到95%以上［3］。但紫外光、部分病原微生物和捕食性天敵對昆蟲病原線蟲有抑制作用［4－6］，因此施用后昆蟲病原線蟲在土壤中的種群數(shù)量會隨時間推移發(fā)生變化，進而影響昆蟲病原線蟲對害蟲的防治效果。生產(chǎn)中線蟲施用后在田間的密度、施用線蟲地塊存活數(shù)量等，對于評價線蟲應(yīng)用效果和線蟲在土壤中定殖很重要，因此，對施入昆蟲病原線蟲的田塊進行昆蟲病原線蟲密度檢測是確保昆蟲病原線蟲防治害蟲效果的重要手段，也是確定是否需要再次施入昆蟲病原線蟲的重要依據(jù)，同樣也是研究過程中的追蹤調(diào)查重要手段。而土壤中線蟲種類繁多、數(shù)量巨大［7－8］，昆蟲病原線蟲僅為土壤線蟲的一種類群［9］，前人對昆蟲病原線蟲定性和定量的監(jiān)測方法有懸浮離心法［10］和誘集法［11］，懸浮離心法要將土壤樣品帶回實驗室后進行相應(yīng)的處理后進行一次離心和兩次懸浮離心。誘集法同樣要將土壤樣品帶回實驗室進行誘集，誘集過程中需人工翻動誘集裝置數(shù)次已達到最佳的誘集效果。這兩種方法需進行田間取樣，該過程會破壞農(nóng)作物，另外在定量監(jiān)測時采用大蠟螟誘集直至土樣中沒有線蟲為止要花費很多時間，同時還要對被侵染的大蠟螟逐頭解剖計數(shù)線蟲，此過程費時費力。所以，準確、快速地確定檢測土壤中昆蟲病原線蟲的密度是試驗研究和線蟲應(yīng)用及技術(shù)指導中急需解決的問題，研究報道了土壤中昆蟲病原線蟲密度定量檢測技術(shù)，該技術(shù)可方便、快捷、準確地檢測土壤中昆蟲病原線蟲密度，并可有效地促進昆蟲病原線蟲試驗研究和應(yīng)用，為研究結(jié)果的實施提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

昆蟲病原線蟲(Heterorhabditis bacteriophora)侵染期線蟲(Infective Juveniles，IJ)由中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所農(nóng)田有害生物控制實驗室保存，試驗用的大蠟螟(Galleria mellonella)屬鱗翅目螟蛾科蠟螟亞科，其幼蟲是昆蟲病原線蟲重要寄主之一，由于大蠟螟幼蟲對昆蟲病原線蟲極為敏感的特點，人們常采用大蠟螟進行昆蟲病原線蟲分離、誘集、繁殖和對昆蟲致病力測定［12］。研究用大蠟螟末齡幼蟲(Galleria mellonella)購于天津惠裕德生物科技有限公司，昆蟲病原線蟲種群密度檢測器為自制，并獲得授權(quán)專利(ZL201010205217.8)。試驗用滅菌土取自本所試驗田耕層黑土，160 ℃下烘干2 h 滅菌備用。生物顯微鏡(Motic s633069)下昆蟲病原線蟲計數(shù)，試驗用長方形塑料盒為32 cm × 23 cm × 15 cm。

1.2 方法

利用昆蟲病原線蟲依賴寄主昆蟲繁殖并具有趨化性的特點，采用室內(nèi)模擬試驗方法，優(yōu)化昆蟲病原線蟲對寄主昆蟲大蠟螟的趨向時間，即昆蟲病原線蟲種群密度檢測器的使用時間的確定，同時優(yōu)化監(jiān)測器之間的距離，確定最佳收集距離。利用昆蟲病原線蟲昆蟲種群密度檢測器檢測土壤中昆蟲病原線蟲種群密度。

1.2.1 昆蟲病原線蟲收集時間優(yōu)化。將4.5 kg 滅菌土裝入長方形塑料盆中，加入511 ml 無菌水和102 ml的線蟲懸浮液，使土壤濕度保持在12%。侵染期線蟲(Infective Juveniles，IJ)按60 萬IJ s·m－2接種線蟲，將昆蟲病原線蟲種群密度檢測器垂直插入塑料盒中。試驗設(shè)接種線蟲后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 5 個時間調(diào)查密度檢測器內(nèi)誘集到的線蟲數(shù)量。收集進入到昆蟲病原線蟲種群密度檢測器中的線蟲懸浮液，顯微鏡下計數(shù)，每處理重復4 次，檢測器間距為8 cm。

1.2.2 昆蟲病原線蟲密度檢測器放置間距優(yōu)化。試驗用塑料盒設(shè)置同上，檢測器放置之間的距離(兩相鄰管管心連線距離)為2 cm 、4 cm 、6 cm 、8 cm 和10 cm，48 h 收集，然后分別收集進入到昆蟲病原線蟲種群密度檢測器中的線蟲懸浮液，顯微鏡下計數(shù)，每處理重復4 次。

1.2.3 檢測標準曲線的建立。優(yōu)化收集時間及檢測器間距后，在土壤中分別按10 萬IJ s·m－2，20 萬IJ s·m－2，40 萬IJ s·m－2，60 萬IJ s·m－2，80 萬IJ s·m－2，100 萬IJ s·m－2七個密度施入昆蟲病原線蟲的侵染期線蟲，48 h 后收集檢測器中管中收集到的昆蟲病原線蟲，并計數(shù)，依據(jù)管中昆蟲病原線蟲的數(shù)量和施入線蟲的密度建立曲線，3 次重復。標準曲線的建立分別在2010 年1 月7 日、3 月18 日和4 月14 日進行試驗重復，并依據(jù)3 次試驗結(jié)果進行最終標準曲線的建立。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用Excel 進行數(shù)據(jù)基本處理，采用DPS v3.01 軟件完成數(shù)據(jù)處理。利用one－way ANOVA 單因素方差分析多重比較(LSD)方法對不同處理數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，差異顯著水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲病原線蟲收集時間優(yōu)化

利用昆蟲病原線蟲對寄主大蠟螟的趨向性進行線蟲密度檢測，檢測過程中發(fā)現(xiàn)昆蟲病原線蟲種群密度檢測器收集時間的長短顯著影響檢測器中收集到的昆蟲病原線蟲的數(shù)量。在24 h 時昆蟲病原線蟲種群密度檢測器就有線蟲出現(xiàn)，線蟲條數(shù)為27 條，見圖1。在24 h 到120 h 區(qū)間線蟲在密度檢測器中的數(shù)量出現(xiàn)了兩次高峰，即測定時間為48 h 與72 h 密度檢測器中線蟲條數(shù)分別為126 條和129 條，且48 h 與72 h兩測定時間之間檢測器收集到昆蟲病原線蟲數(shù)量差異較小，但與其他測定時間之間差異顯著(p ＞0.05)，72 h 后密度檢測器中線蟲數(shù)量開始緩慢下降，直至96 h 之后密度檢測器中線蟲數(shù)量基本處于平穩(wěn)階段。分析原因可能是昆蟲病原線蟲需要一定的活動空間，且在檢測器中昆蟲病原線蟲的數(shù)量達到一定程度即昆蟲病原線蟲在收集管中的密度達到一定的臨界值時，因空間、氧氣等外界條件的限致使昆蟲病原線蟲爬出，導致檢測器中昆蟲病原線蟲數(shù)量降低。48 h 和72 h 兩個收集時間之間昆蟲病原線蟲種群密度檢測器中昆蟲病原線蟲數(shù)量差異不顯著(p ＞0.05)，從節(jié)省時間以及試驗的準確度上考慮，48 h 為昆蟲病原線蟲密度檢測器的最佳收集時間。

圖1 不同收集時間EPN 對大蠟螟趨性影響Fig.1 Effects of different collection time on the trend from EPN to Galleria mellonella

2.2 昆蟲病原線蟲密度檢測器間距優(yōu)化

預試驗中發(fā)現(xiàn)，病原線蟲種群密度檢測器對昆蟲病原線蟲的檢測效率受檢測器之間距離影響，因此，研究對昆蟲病原線蟲種群密度檢測器施用間距進行了優(yōu)化。在檢測器間距為8 cm 時昆蟲病原線蟲種群密度檢測器的收集數(shù)目達到最大，達18 條/管，顯著高于間距為2 cm、4 cm、6 cm 和10 cm 時昆蟲病原線蟲種群密度檢測器的收集數(shù)目，與其他4 個距離差異顯著，見圖2。當收集管之間的距離過近時昆蟲病原線蟲在一定范圍內(nèi)土壤中的數(shù)量有限，因此昆蟲在每個檢測器中收集到的數(shù)量較低。當檢測器之間的距離過大時，寄主釋放的信息物質(zhì)濃度低于檢測器間距小的情況。綜合土壤中昆蟲病原線蟲的數(shù)量和寄主昆蟲釋放出的信息物質(zhì)的濃度兩種因素，認為昆蟲病原線蟲種群密度檢測器的最佳使用間距為8 cm。

圖2 不同距離EPN 對大蠟螟趨性Fig.2 Effect of distance between collection tubes on the trend from EPN to Galleria mellonella

2.3 檢測標準曲線的建立

2.3.1 標準曲線的建立。昆蟲病原線蟲檢測器中收集到昆蟲病原線蟲的數(shù)量與盒外土壤中昆蟲病原線蟲的密度具有顯著的相關(guān)性，因此通過3 次室內(nèi)模擬試驗建立昆蟲病原線蟲種群密度檢測器中收集到的線蟲數(shù)量和土壤中昆蟲病原線蟲密度的關(guān)系曲線，見圖3。在標準曲線建立的3 次重復試驗中，第一次和第三次結(jié)果表明土壤中昆蟲病原線蟲的密度和檢測器中收集到的昆蟲病原線蟲的條數(shù)顯著相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)R2分別為0.902 4 和0.936 4。但在第二次標準曲線建立的重復試驗中二者之間的相關(guān)系數(shù)R2僅為0.707 2，分析其中的原因可能為在進行第二次室內(nèi)模擬實驗時室內(nèi)溫度較低，前兩次重復實驗在正常室溫下進行，室溫范圍在17 ℃～20 ℃之間，而第三次試驗因天氣原因，室內(nèi)氣溫低于16 ℃，致使昆蟲病原線蟲的活動較緩慢。

2.3.2 最終標準曲線建立。綜合3 次試驗結(jié)果，建立最終大蠟螟對昆蟲病原線蟲趨性標準曲線，見圖4。昆蟲病原線蟲檢測器中收集到的昆蟲病原線蟲與土壤中昆蟲病原線蟲的密度顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2達到0.929 5。

4 討 論

在利用昆蟲病原線蟲控制害蟲時，研究者或植物保護工作者將昆蟲病原線蟲釋放到田間進行害蟲防治后，需要跟蹤監(jiān)測線蟲在土壤中的存活情況以便決定下一次應(yīng)用的必要性、應(yīng)用時間及用量。研究方法在進行定性及定量試驗時無需將土壤取回且不破壞田間作物，較前人研究的方法更快速簡便。昆蟲病原線蟲的活動能力和侵染能力受到很多外界的影響，在外界環(huán)境因素出現(xiàn)變化的時候標準曲線也要重新建立，是否可以建立一個具有普遍適用性的標準曲線以減少實際操作時的步驟，是此方法有待改進之處。目前為止該技術(shù)在田間應(yīng)用時應(yīng)根據(jù)不同條件對標準曲線進行適當校正和調(diào)整后再進行田間應(yīng)用。研究收集時間是在節(jié)省時間的前提下選定的，而在實際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)實驗要求的不同對收集時間進行相應(yīng)的調(diào)整，若以收集昆蟲病原線蟲為目的則應(yīng)重新確定收集到昆蟲病原線蟲數(shù)量最多的時間，已達到收集量最大的目的。此方法只針對一種昆蟲病原線蟲進行試驗，是否對其他品系的昆蟲病原線蟲有效還需要進一步實驗確定。

圖3 EPN 對大蠟螟趨性標準曲線Fig.3 Standard curve of the trend from EPN to Galleria mellonella

圖4 EPN 對大蠟螟趨性標準曲線(最終)Fig.4 Standard curve of the trend from EPN to Galleria mellonella (Final)

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