連騰祥，王光華，于鎮(zhèn)華，劉居?xùn)|，金 劍，劉曉冰

(1. 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所中國科學(xué)院黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150081;2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

0 引 言

碳(C)元素是組成生命物質(zhì)的主要成分之一［1］。大氣中的CO2是植物碳的主要來源，光合作用將大氣CO2合成為植物有機(jī)碳，并固定在植物體內(nèi)，部分固定的有機(jī)碳向土壤釋放，在土壤微生物作用下發(fā)生進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化［2］。研究表明，每年約十分之一的大氣CO2通過植被進(jìn)入土壤［3］。因此，碳的固定是生物在地球上生存的一個(gè)基礎(chǔ)［2］。土壤微生物可以利用植物釋放的光合碳并將其中的一部分轉(zhuǎn)化為土壤有機(jī)碳，是土壤有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的動(dòng)力［4－6］，在土壤有機(jī)碳轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定土壤碳庫方面起著非常關(guān)鍵的作用［7］。因此，解析根際微生態(tài)系統(tǒng)中碳轉(zhuǎn)化以及利用光合碳的微生物種類對于有效提高作物生產(chǎn)力、促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展具有非常重要的意義。近期發(fā)展起來的穩(wěn)定性同位素探測技術(shù)(stable isotope probing，SIP )可以確定參與碳轉(zhuǎn)化的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，以及復(fù)雜群落中微生物的相互關(guān)系，比傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物方法有更大優(yōu)勢和發(fā)展空間［8－11］。簡要概述了國內(nèi)外光合碳轉(zhuǎn)化的相關(guān)動(dòng)態(tài)，討論了土壤微生物在光合碳轉(zhuǎn)化過程中的重要性，重點(diǎn)綜述了SIP 技術(shù)及其分析原位微生物的代謝功能以及多樣性的進(jìn)展和問題。

1 光合碳在植物地下部的分配

光合碳是“大氣－植物－土壤”系統(tǒng)碳循環(huán)的重要組成部分。大氣圈、土壤圈和生物圈三者之間的元素循環(huán)使該系統(tǒng)形成了動(dòng)態(tài)有機(jī)體。植物的光合作用和土壤的呼吸作用是這種動(dòng)態(tài)有機(jī)鏈的基本代謝過程，二者共同驅(qū)動(dòng)碳的生物地球化學(xué)循環(huán)過程［12］。通過光合作用形成的有機(jī)化合物約占植物干質(zhì)量的90%，而碳是構(gòu)成有機(jī)化合物的主要骨架［12］。光合碳經(jīng)過植物的韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)到地下，一部分用于根系生長，一部分以根系沉積物的形式輸入根際土壤環(huán)境中［13］，并被土壤微生物作用后部分以CO2和CH4等氣體的形式返回大氣中，或以有機(jī)質(zhì)形式貯存于土壤中［12］。這樣就形成了大氣－植被－土壤－大氣整個(gè)陸地生態(tài)系統(tǒng)的碳循環(huán)［1］。

光合碳向地下部分配的比例因植物光合途徑的不同而存在差異。研究表明，小麥(C3植物)生育期內(nèi)，約有30%～60%光合碳轉(zhuǎn)運(yùn)到地下部分［14］。亞熱帶地區(qū)的水稻(C3植物)凈同化碳分配到根部和土壤中的比例分別約為10%和5%［15］。然而，玉米(C4植物)光合碳只有0.5%～10%被轉(zhuǎn)運(yùn)到土壤中［16］。

光合碳在地下部的分配也因生育時(shí)期不同而發(fā)生較大的變化。何敏毅等［17］報(bào)道了玉米的苗期、拔節(jié)、抽雄和灌漿期，向地下轉(zhuǎn)移的13C 比例分別為43.2%、46.5%、30.3%和20.0%。Swinnen 等［18］研究表明小麥成熟期向地下分配的碳量少于生長前期，拔節(jié)期向地下部分配30%～40%的光合碳，而成熟期僅有5%～20%［19］。Jin 等［20］用13CO2標(biāo)記大豆，發(fā)現(xiàn)大豆分配到地下部分的光合碳在苗期和鼓粒期分別為18.4%和3.5%。

2 土壤微生物和光合碳之間的相互作用

在植株生長期間，光合碳以根系分泌物及脫落物的形式向土壤釋放，在根際微生物群落演替以及種群格局變化上起到重要的作用。早期人們主要集中在碳水化合物和氨基酸上的研究，并發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)不僅為根際微生物提供大量的碳源與氮源，也影響著根際微生物的多樣性［21］。研究表明，30%～40%的土壤有機(jī)質(zhì)來自根系分泌物和死亡的根［22］。根系分泌物中的碳將植物根系、土壤和微生物連為一體，是根際微生態(tài)系統(tǒng)正常運(yùn)行的基本動(dòng)力。同時(shí)微生物也刺激了根系分泌物的釋放，這必然會(huì)影響到植物－土壤－微生物之間碳的平衡［13，23］。Chaboud 等［24］研究指出，玉米不同生育期的土壤微生物分布明顯不同，是因?yàn)楦捣置谖镏械鞍踪|(zhì)與總糖含量在不同時(shí)期差異明顯。Xu 等［25］研究指出，生育時(shí)期的變化是影響大豆根際土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)變化的重要因素。

土壤微生物也是推動(dòng)碳在土壤－大氣循環(huán)過程中的重要組成成分［26］。例如，微生物剌激一些植物激素的產(chǎn)生提高了細(xì)胞膜通透性［27］。一些細(xì)菌產(chǎn)生的檸檬酸可以促進(jìn)菌根的生長［28］;菌根增強(qiáng)植物的光合速率［29］;以及微生物對根的機(jī)械損傷作用［27］。這些因素都可利于根系分泌物的釋放，從而影響碳在整個(gè)根際微生態(tài)系統(tǒng)中的平衡。因而，了解和探究與碳轉(zhuǎn)化相關(guān)的微生物特征，尤其是利用光合碳的微生物群落結(jié)構(gòu)變化，對于系統(tǒng)揭示農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過程響應(yīng)的微生物機(jī)制有重要意義。

3 穩(wěn)定性同位素探針技術(shù)(SIP)及其發(fā)展

如何將某種特定微生物和它們的功能聯(lián)系到一起，是鑒定碳轉(zhuǎn)化相關(guān)微生物特征的關(guān)鍵問題。以前人們解決上述問題都是在確定某種微生物的生理、生化和遺傳水平之后，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)單獨(dú)培養(yǎng)。這樣，代謝特性和細(xì)胞間的相互作用可用于推斷微生物和與其親緣關(guān)系較近的微生物在自然環(huán)境中可能存在的功能。然而，這些微生物只代表廣泛分布于環(huán)境中的一小部分［8］，因此，培養(yǎng)方法丟失了大量有關(guān)微生物功能的信息。雖然近幾十年來梯度凝膠電泳(PCR－DGGE/TGGE)和熒光原位雜交(FISH)等分子生物學(xué)技術(shù)不斷的應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)中，大大提高了人們對微生物遺傳多樣性的認(rèn)識(shí)，但得到的結(jié)果仍不足以提供相關(guān)微生物間的相互作用及其代謝功能的直接信息［30］。

近期發(fā)展起來的穩(wěn)定性同位素探測技術(shù)(SIP)是連接某種特定微生物和它們功能的一種功能強(qiáng)大的新方法［9－10］。這種方法也被用來追蹤根際環(huán)境中利用光合碳的活躍微生物［11］。其原理是基于自然界中13C的比例約占1%，當(dāng)用13C 標(biāo)記的底物來培養(yǎng)微生物時(shí)，通過微生物的代謝合成使得13C 進(jìn)入磷脂脂肪酸(PLFA)以及核酸(RNA 或DNA)中，被標(biāo)記物質(zhì)的分子量隨之增加，通過GC、GC/MS 或GC/C/IRMS測定PFLA 中13C 的相對豐度，進(jìn)而觀察13C 在微生物中的分配情況，確定功能微生物類群［30－31］。DNA 和RNA－SIP 則需以CsCl (或三氟乙酸銫，CsTFA)為介質(zhì)對核酸進(jìn)行超高速密度梯度離心，將核酸中標(biāo)記13C 和未標(biāo)記組分區(qū)分開，較重的磷脂脂肪酸或核酸分子所代表的即為代謝活躍的微生物類群［32］。

3.1 PLFA－SIP

在SIP 實(shí)驗(yàn)中，最早使用的特異性生物標(biāo)志物是PLFA［33］。一般來說，只要有少量的13C 被同化到PLFA 中，就足夠使研究者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。Bahn 等人［34］利用PLFA－SIP 研究在間斷供給13CO2的情況下，高山草原地下部13C 的分配并沒有受到影響，但碳源強(qiáng)度卻影響到土壤微生物對近期光合碳的利用和轉(zhuǎn)化，并驗(yàn)證了光合碳可以迅速分配到根系和微生物群落當(dāng)中。Lu 等［35］利用PLFA－SIP 的方法檢測了水稻根際中利用近期光合碳活性微生物的空間變異，結(jié)果顯示活性微生物在水稻根系存在水平和垂直的變化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)吸收利用近期光合碳的微生物主要是革蘭氏陽性菌以及真核微生物。

雖然PLFA－SIP 的靈敏度高，但是由于某些PLFA 并不具有特異性，不同的微生物種類可能會(huì)有某一種或幾種類似的磷脂脂肪酸組成，很難判斷檢測出的磷脂脂肪酸代表哪種的微生物類群［36］。所以這種方法暫時(shí)還不能為轉(zhuǎn)化光合碳的微生物提供系統(tǒng)發(fā)生學(xué)信息。

3.2 DNA－SIP

同PLFA 相比，基于核酸(DNA 或RNA)的SIP 可以為我們提供大量有關(guān)微生物遺傳多樣性和分子生態(tài)學(xué)方面的信息［37］。

DNA－SIP 的理論基礎(chǔ)并不是最近才發(fā)現(xiàn)的，早在1958 年，Meselson 和Stahl［38］就預(yù)言，當(dāng)DNA 的分子被標(biāo)記導(dǎo)致密度增加時(shí)，DNA 在復(fù)制過程中親代和子代之間分子分配的問題就可能會(huì)被解決。他們不僅證明了大腸桿菌可以生長在標(biāo)有15N 和14N 的穩(wěn)定性同位素氮源(NH4Cl)上，而且也引入了氯化銫(CsCl)密度梯度離心技術(shù)。核苷酸中含有大量的碳和氫，也可以被較重的穩(wěn)定性同位素13C 和2H 標(biāo)記［39］。盡管DNA 的浮力密度隨鳥嘌呤－胞嘧啶(G+C)的含量不同而有著較大變化［40］，但是由于自然界中存在的穩(wěn)定性同位素比例非常低，利用高豐度13C 同位素為底物還是會(huì)使標(biāo)記和未標(biāo)記的DNA 產(chǎn)生較大的差異。

DNA－SIP 最重要的特征是:經(jīng)等密度梯度離心分層后收集到較重的DNA (13C－DNA)，包含微生物種群的基因組。因此，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物的SSU (核糖體小亞基)rRNA 基因是鑒定它們不可或缺的基礎(chǔ)。可以根據(jù)已知可培養(yǎng)微生物的代謝功能設(shè)計(jì)出相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［41］。Radajewski 等［9］在這些原理的基礎(chǔ)上首次闡述了DNA－SIP 的應(yīng)用。

雖然以13CH3OH、13CH4或13CO2(99%13C 的碳原子含量)為基質(zhì)的DNA－SIP 研究多集中在甲烷氧化過程［42－43］或是氨氧化上［44］，但近期有關(guān)碳轉(zhuǎn)化微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究越來越多。Ostle 等［45］在草地上標(biāo)記了13CO2，結(jié)合DNA－SIP 發(fā)現(xiàn)釋放到土壤中的13C 在5 h～48 h 后出現(xiàn)第一個(gè)高峰，并且在136 h 后出現(xiàn)次高峰。Bernard 等［46］用DNA－SIP 技術(shù)對水稻根尖進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ɑ 和γ 變形菌、鞘氨醇桿菌和灰色鏈霉菌可能是水稻根尖細(xì)胞的主要降解菌，并且這些細(xì)菌與培養(yǎng)在愈傷組織上的細(xì)菌不同。Lee 等［47］用葡萄糖－13C 培養(yǎng)的水稻根尖細(xì)胞，利用DNA－SIP 技術(shù)鑒定分解根尖細(xì)胞的細(xì)菌，結(jié)果表明70%以上是革蘭氏陰性菌，而在水分較少的愈傷組織上培養(yǎng)的分解者只有38%的細(xì)菌為革蘭氏陰性菌。

被標(biāo)記的微生物DNA 所需要的底物，以及被標(biāo)記的時(shí)間是DNA－SIP 研究的限制源。在提取DNA前，長時(shí)間的標(biāo)記(大于40 d)已在少量土壤樣品(小于10 g)中應(yīng)用，并且可以在CsCl 梯度中檢測到被標(biāo)記的DNA［9］。當(dāng)標(biāo)記底物在體積較大(200 ml)的條件下標(biāo)記時(shí)，僅需要較短的同化時(shí)間(5 d)［44］。但以上兩種標(biāo)記都會(huì)產(chǎn)生中間代謝產(chǎn)物，而這些物質(zhì)又可以被非目標(biāo)微生物所利用(交互飼喂)。交互飼喂的效果可能會(huì)對DNA－SIP 實(shí)驗(yàn)造成一系列持續(xù)的影響和改變。另外，即使在高度活躍的生物反應(yīng)系統(tǒng)中，DNA 的周轉(zhuǎn)率也相對較低，得到足夠被標(biāo)記的DNA 相對比較困難［48］。所以，還需要找到更加靈敏的方法來鑒定有關(guān)碳轉(zhuǎn)化微生物的群落特征［9］。

3.3 RNA－SIP

與DNA－SIP 技術(shù)相似，以RNA 為基礎(chǔ)的穩(wěn)定同位素探測技術(shù)(RNA－SIP)同樣也適用于研究特定的微生物種類和功能［41］。Manefield 等［49］認(rèn)為在SIP 實(shí)驗(yàn)中，RNA 是一種比DNA 更加敏感的生物標(biāo)記物，這是因?yàn)樵诨钴S的細(xì)胞中，RNA 的合成速率更高，而且在不需要合成或復(fù)制DNA 的情況下也可以進(jìn)行標(biāo)記。從序列分辨率的角度來看，微生物所提供的SSU (核糖體小亞基)rRNA 基因，可以使我們在不知道任何相關(guān)信息的情況下，辨別出微生物的生物化學(xué)過程［41］。Lu［50］等已經(jīng)證明RNA－SIP 可以適用于識(shí)別植物－土壤系統(tǒng)中利用根際碳的活躍微生物，并認(rèn)為水稻根際環(huán)境中，吸收利用光合碳的微生物是ɑ 和β變型菌門。Drigo 等［51］將莎草置于13CO2的環(huán)境中，并利用RNA－SIP 技術(shù)發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌(AMF)是碳在植物和土壤之間運(yùn)移的重要參與者。

RNA－SIP 和DNA－SIP 之間最根本的不同是，RNA 依賴目標(biāo)微生物的轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)。因此，RNA－SIP 一個(gè)主要優(yōu)勢是細(xì)胞里rRNA 的自然擴(kuò)增。此外，在一定濃度數(shù)量的樣品中，RNA 的標(biāo)定速率遠(yuǎn)高于DNA 的標(biāo)定速率［48］。這就表明，RNA－SIP 可能比DNA－SIP 更加敏銳，因此這種方法在更少底物和更短標(biāo)記時(shí)間的情況下就可以達(dá)到我們需要的結(jié)果。

RNA－SIP 中還需要考慮到一系列重要的因素，如RNA 比DNA 有著較高的浮力密度，被評測的幾個(gè)浮力密度梯度表明，用銫三氟乙酸乙酯(CsTFA)來代替CsCl 作為離心介質(zhì)可以取得更好的效果［48］。由于RNA 可以吸收UV 光，因此直接觀察RNA 是不合理的。所以大多數(shù)的研究是用蠕動(dòng)泵和注射器一起分層含有RNA 的梯度(最多20 層)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，幾乎所有的目標(biāo)RNA 都集中在3 個(gè)或4 個(gè)浮力密度梯度中。然而，RT－PCR (反轉(zhuǎn)錄RCR)擴(kuò)增檢測到的RNA 橫跨整個(gè)浮力密度梯度。所以解決這一問題的關(guān)鍵是對每一層浮力密度梯度進(jìn)行RT－PCR 和變性梯度凝膠電泳分析，并且觀察標(biāo)記帶的強(qiáng)度變化［49］。

4 SIP 存在的問題與展望

DNA－SIP 和RNA－SIP 的應(yīng)用仍處于起步階段，仍然有許多技術(shù)方面的問題沒有得到充分的解決。追蹤一個(gè)特定的生物化學(xué)過程是否能用SIP 技術(shù)，主要考慮的因素是看目標(biāo)有機(jī)體的核酸是否能標(biāo)記上足夠的13C 標(biāo)記的原子，以達(dá)到可以收集到足夠13C 核酸的程度［44，49］。一系列的實(shí)驗(yàn)研究表明，RNA 被標(biāo)記的13C 至少要達(dá)到20%，才可以和12C 區(qū)分開來，以達(dá)到鑒別微生物并發(fā)掘與其代謝功能之間的聯(lián)系［52］。同時(shí)，這一數(shù)值要比以前評估DNA－SIP 中的數(shù)值要低［9］。微生物DNA (12C)G +C 比例范圍為35%～70%，其對應(yīng)的浮力密度范圍大概為1.69 g·cm－3～1.73 g·cm－3［40］。然而，含有100%13C 的相同DNA，其浮力密度大概為1.75 g·cm－3～1.79 g·cm－3。所以，當(dāng)提取環(huán)境樣品時(shí)，最好能使其核酸13C 含量大于50%，以避免12C－DNA 中可能會(huì)存在過高的G+C 含量，進(jìn)入13C－DNA 的組分，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果［41］。

目前，濃度較高(如10%CH4或500 μg·ml－1苯酚)且大量的標(biāo)記底物已被用于標(biāo)記核酸。然而，盡管是在像土壤這樣的復(fù)雜環(huán)境內(nèi)，SIP 也很容易受到微生物富集的影響［9，44］。研究表明標(biāo)記最重部分的13C－DNA 包含目標(biāo)微生物的序列，也可能包括有著緊密營養(yǎng)關(guān)系的微生物。SSU (核糖體小亞基)rRNA 是鏈接微生物功能和類別較好的生物標(biāo)志物候選，但RNA－SIP 在自然樣品中的應(yīng)用存在限制，這可能是因?yàn)樘挤€(wěn)定性同位素的測定需要大量的RNA (10 μg～100 μg)［52］，提高13C 含量的一種方法要基于細(xì)胞本身對rRNA 的捕獲能力，然而許多生物合成及分解途徑導(dǎo)致了離心后其它同位素的分層，這些分層很可能會(huì)比RNA 分層更為嚴(yán)重［41］。

隨著SIP 技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，其應(yīng)用領(lǐng)域也從先前的甲烷氧化菌中的應(yīng)用拓展到根際微生物生態(tài)學(xué)和環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域中，并為我們提供了許多關(guān)于微生物遺傳多樣性的信息［53］。

SIP 技術(shù)除了與上述的梯度凝膠電泳(PCR－DGGE/TGGE)等技術(shù)相結(jié)合外，其DNA－SIP、RNA－SIP 以及PLFA－SIP 三者之間也可以相互結(jié)合，彌補(bǔ)各自的缺陷與不足。如Drigo 等［51］利用RNA－SIP 和PLFA－SIP 技術(shù)的結(jié)合，以莎草為研究對象，示蹤影響土壤微生物的光合碳，提出升高大氣中CO2濃度可以增加植物吸收C 的效率，從而影響植物的生理動(dòng)態(tài)。植物固定的C 可以加快植物根部C 周轉(zhuǎn)，增強(qiáng)C向土壤中轉(zhuǎn)移速率以及表皮細(xì)胞、植物組織脫落程度和增加根系分泌物釋放。Pratscher 等［54］利用RNA－SIP 和DNA－SIP 研究了土壤氨氧化古細(xì)菌和細(xì)菌的活性，闡述了氨氧化和CO2同化的高度耦合，并證明了土壤中氨氧化古菌固定CO2的機(jī)制是3－羥基－4－羥基丁酸酯循環(huán)。

此外，該技術(shù)還可以與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，有助于人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)參與土壤植物體系碳循環(huán)的特定微生物，并通過研究其基因，闡明其作用機(jī)制，從而為今后有效控制土壤作物體系中有機(jī)碳利用與周轉(zhuǎn)等提供新的思路與方法。

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