徐 丹， 孟 宇， 胡 波， 馮艷艷， 尹良紅

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州510630)

我國糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)展至終末期腎功能衰竭的人數(shù)逐漸增加［1］，DN 維持性血透(maintenance hemodialysis，MHD)患者約為總血透人數(shù)的36.39%［2］。使用無糖透析液血液透析過程中，DN 患者低血壓、低血糖等并發(fā)癥發(fā)生率較高，影響透析質(zhì)量，目前研究發(fā)現(xiàn)使用含糖透析液明顯減少這些并發(fā)癥的發(fā)生［3-4］，然而含糖透析對患者機(jī)體代謝的影響尚未明確。代謝組學(xué)是研究生物體系受外部刺激而產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物的變化及其動態(tài)變化的規(guī)律［5］，可用于探索含糖透析的代謝特征。本研究采用高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(high-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry，HPLC-MS/MS QTOF)，其具有分析速度快、靈敏度及分辨率高、質(zhì)量范圍寬的特點(diǎn)，有助于在分析血清樣本全體代謝物，初步研究單次含糖透析的代謝特征。

材 料 和 方 法

1 研究對象

根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)選擇在我院門診MHD 患者10 例，原發(fā)病均為2 型糖尿病、糖尿病腎病，采用自身對照研究，形成無糖透析組(glucose-added dialysate group，G－組)和含糖透析組(glucose-free dialysate group，G+組)，另在我院體檢中心隨機(jī)選取10例健康人形成健康對照組(healthy control group，H組)。MHD 患者血液透析前不使用胰島素。

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合ESRD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)生肌酐清除率≤10 mL/min;(2)年齡＞18 歲，規(guī)律透析3 個月以上，每周3 次，每次4 h;(3)2 周內(nèi)沒有使用除胰島素以外的影響血糖的藥物及任何調(diào)脂藥物，取血前2 d 空腹血糖及餐后2 h 血糖分別控制在7.77 mmol/L 與11.10 mmol/L 以內(nèi)。實(shí)驗(yàn)前均使用無糖透析液血透。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)研究進(jìn)行時(shí)的現(xiàn)癥感染患者;(2)1 個月內(nèi)有嚴(yán)重心力衰竭、心肌梗死等心血管合并癥，及嚴(yán)重貧血、心力衰竭、出血傾向，急性腦血管意外、肝功異常、肝硬化等疾病患者;(3)血透中發(fā)生低血糖或低血壓患者退出本研究，低血糖的診斷標(biāo)準(zhǔn):血糖＜3.9 mmol/L(據(jù)2010 中國糖尿病指南);低血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn):收縮壓＜90 mmHg(1 mmHg =0.133 kPa);(4)不愿簽署知情同意書患者。

2 血液透析方法

采用德國費(fèi)森尤斯4008S 透析機(jī)，聚風(fēng)膜中空纖維透析器，膜面積為1.6 m2，超濾系數(shù)6.4 mL·h－1·mmHg－1。G－組采用廣州康盛生物科技有限公司提供無糖碳酸氫鹽透析液，其成分為:鈉離子135.0 mmol/L，鉀離子2. 0 mmol/L，鈣離子1. 25 mmol/L，鎂離子1.0 mmol/L，氯離子108.6 mmol/L，醋酸鹽6.0 mmol/L，碳酸氫鹽30.0 mmol/L，含糖透析液由相同廠家提供，葡萄糖濃度為5.5 mmol/L，余成分同無糖透析液。透析時(shí)間4 h，血流速200 ～230 mL/min，透析液流速500 mL/min、溫度37 ℃，超濾量＜干體重×5%，全身肝素化抗凝，首劑20 mg，6 mg/h 持續(xù)泵入，透析結(jié)束前30 min 停止泵入。

3 樣本采集及制備

受試者樣本均在空腹8 h 以上并于晨間7:30 食用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐后30 min 采集，MHD 受試者無菌采集血液透析前、后周圍靜脈血5 mL，健康對照組與MHD 患者采血間隔一致，作為血液透析前、后健康對照，采血間期均不進(jìn)食。靜脈血注入促凝采血管內(nèi)，常溫下靜置15 min 后3 000 r/min 離心5 min，取上清液置于EP 管中儲存于－80 ℃的冰箱內(nèi)待測。檢測時(shí)，樣本于室溫下解凍，取100 μL 樣本加入無水甲醇300 μL 置于1.5 mL EP 管漩渦混勻，13 200 r/min 離心5 min，取上清液作為檢測血清樣本。

4 儀器與條件

4.1 色譜條件 美國Agilent 1200 系列高效液相色譜儀(Agilent 1200 HPLC):ZORBAX SB-C18 柱(150 mm ×2.1 mm，內(nèi)徑1.8 μm)，柱溫25 ℃;進(jìn)樣量20 μL，流速0.25 mL/min。流動相:A 為甲醇(色譜醇，J ＆ K Chemica)，B 為純凈水;梯度洗脫:1 ～5 min，A∶B 為50∶50;6 ～35 min，A∶B 為95∶5。

4.2 質(zhì)譜條件 Bruker 公司microTOF-QⅡ質(zhì)譜儀，電噴霧離子源(ESI)，正離子電離模式，TOF 離子飛行方式采用V 模式，帽電壓－500 V，毛細(xì)管電壓3 500 V，霧化器壓力0.6 bar，干燥氣流速6.0 L/min，干燥氣溫度180 ℃，全程掃描質(zhì)譜分析時(shí)碰撞電壓7 eV，離子化電壓5 eV，采集速度為0.1s，校正溶液進(jìn)樣速度100 μs/min，校正頻率為5 s，四極桿掃描范圍質(zhì)荷比(mass charge ratio，M/Z)50 ～1 000;二級質(zhì)譜分析時(shí)碰撞電壓10 ～40 eV 不等。

5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Markerlynx 軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰檢測和匹配，利用SIMCA-P 12.0 軟件將全部樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出，以M/Z、保留時(shí)間(retention time，RT)和峰強(qiáng)度(intensity)為數(shù)據(jù)，使用SIMCA-P 12.0 自帶程序進(jìn)行正交信號校正(orthogonal signal correction，OSC)，其中的組別變量為Y 變量，并用主成分分析(principal component analysis，PCA)和OSC-偏最小二乘判別分析(partial least square discriminate analysis，PLS-DA)來分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0 軟件完成，采用獨(dú)立或配對樣本t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)使用METLIN Database 查詢相關(guān)可能候選物信息(http://metlin. scripps. edu/metaba_search_alt2.php)。

結(jié) 果

1 研究對象一般情況

血液透析后患者血糖G－組和G+組有顯著差異，G+組高于G－組，超濾量、空腹、血液透析前血糖等指標(biāo)無顯著差異。H 組與MHD 組在年齡、性別等方面無顯著差異，而血紅蛋白和血糖有顯著差異，見表1。

表1 研究對象一般情況Table 1. General characteristics of the subjects (mean±SD.n=10)

2 代謝組學(xué)結(jié)果與分析

2.1 G－組、G+組和H 組的TIC 圖 血清樣品經(jīng)LC-MS/MS Q-TOF 分析，代表性單個總離子流圖(total ion chromatograms，TIC)顯示血液透析前G－組和G+組血清樣本色譜峰總離子流在28 ～35 min 段有差異，說明血液透析前G－組和G+組部分代謝物可能存在差異;血液透析后G－組與G+組、H 組與血液透析前、后MHD 組血清樣本色譜峰總離子流在同一保留時(shí)間色譜峰大小、高低表達(dá)有差異，說明血液透析后G－組和G+組代謝物存在差異，H 組與血液透析前、后MHD 組代謝物均存在差異，見圖1。

2.2 G－組、G+組和H 組的PCA 分析 用SIMCA-P 12.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto 縮放，將信號強(qiáng)度相對總強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理后進(jìn)行PCA。各樣品在第一主成分與第二主成分構(gòu)成的平面上的投影得分圖即PCA 得分圖能夠直觀反映樣品間的相似或差異性［4］。由圖2、3 可見，PCA 模型可將血液透析前、血液透析后MHD 組與H 組樣本完全區(qū)分，即MHD 患者與研究中健康人代謝狀態(tài)不同。圖2 中，G+組與G－組血清樣本血液透析前分布較一致，即2 組透析前代謝狀態(tài)無明顯差異，具有可比性;圖3 中，模型雖然不能有效區(qū)分血液透析后G+組與G－組，但G－組血液透析后組內(nèi)代謝狀態(tài)差異大。

Figure 1. TIC of the 3 groups.A:G － group before hemodialysis;B:G + group before hemodialysis;C:H group one hour after meals;D:G － group after hemodialysis;E:G + group after hemodialysis.圖1 3 組的TIC 圖

Figure 2. PCA score plot of the 3 groups before the hemodialysis.圖2 血液透析前3 組樣本的PCA 得分圖

Figure 3. PCA score plot of the 3 groups after the hemodialysis.圖3 血液透析后3 組樣本的PCA 得分圖

3 血液透析后G－組和G+組的OSC-PLS-DA 分析

PCA 模型示H 組與MHD 組患者代謝狀態(tài)差異明顯，且不能排除透析因素影響，本研究進(jìn)一步對比分析未納入H 組患者血清樣本。為了減少除透析液因素外，血透患者的個體差異對分析結(jié)果的正確性影響，采用OSC 對數(shù)據(jù)濾噪，保留有效的數(shù)據(jù)信息，提高模型的效力和說明能力。OSC 后建立OSC-PLSDA 模型，R2X =0.395，R2Y =0.947，Q2 =0.918。圖4、5 分別為透析后G－組和G+組的OSC-PLS-DA得分圖(圖4)和載荷圖(圖5)。與圖3 相比，圖4 中血液透析后G－組、G+組血清樣本完全區(qū)分開，可見其代謝物狀態(tài)存在差異，亦表明OSC-PLS-DA 比PCA 具有更好的分類能力。圖5 表示樣本中檢測到的代謝物的分布，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，對分離貢獻(xiàn)越大，可能是差異代謝物。

4 血液透析后G－組和G+組差異代謝物鑒定

本研究質(zhì)譜數(shù)據(jù)主要經(jīng)過去噪音、質(zhì)譜峰提取、反卷積處理、峰排列、對齊、合并、縫隙填補(bǔ)處理、數(shù)據(jù)導(dǎo)出等過程處理海量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以避免潛在標(biāo)志物篩選受到干擾。VIP 值可以量化OSC-PLS-DA 載荷圖上每個變量對分類的貢獻(xiàn)。VIP 值越大變量在不同類間的區(qū)別最顯著。對VIP ＞3 的變量進(jìn)行配對樣本t 檢驗(yàn)，將t 檢驗(yàn)中P ＜0.05 的變量作為主要差異性代謝物，再根據(jù)M/Z 在參考文獻(xiàn)及METLIN代謝物數(shù)據(jù)庫中查詢，并與二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對從而確定差異代謝物分子式及名稱(詳見表2)。具體過程如下:以RT 28.25 min、M/Z 為377.0305 的目標(biāo)代謝物為例，據(jù)分析物電噴霧正離子模式加H的機(jī)理，目標(biāo)代謝物［M+H］+代謝物離子的M/Z 為377.0305，據(jù)RT 為28.25 min 的質(zhì)譜圖(圖6A)，離子代謝物［2M +H］+(M/Z 655.6008)、［M +Na］+(M/Z 394.0316)和［M-2H］－(M/Z 331.2276)可能來源于同一目標(biāo)代謝物。以代謝物離子［M +H］+(M/Z 377.0305)為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，同時(shí)優(yōu)化碰撞能量，選擇豐度較高的2 種碎片離子作為定性與定量特征離子，最大程度提高檢測的靈敏度。其二級質(zhì)譜分析得到［M-2H］－(M/Z 331.2276)及［MH］－(M/Z 44.9882)豐度最高(圖6B)，在METLIN Database 搜索與［M+H］+(M/Z 377.0305)相匹配的代謝物，并與其二級質(zhì)譜進(jìn)行分析對比，推斷出此代謝物為石膽酸，分子量為376.2977，分子式見圖6C。以此類推，得出其余4 種物質(zhì)的分子量和分子式。

討 論

本實(shí)驗(yàn)利用HPLC-MS/MS Q-TOF 分析單次使用含糖透析液與無糖透析液DN 維持性血液透析后患者血清代謝物差異，最終得到G+組氫化可的松、石膽酸和天冬氨酸較G－組含量低，而N-甲基煙酰胺和二羥基前列腺素F 較G－組含量高。

氫化可的松作為內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的一種，通過促進(jìn)肝臟糖異生、脂肪細(xì)胞及肌肉組織對葡萄糖攝取和利用，升高血糖。同時(shí)還增強(qiáng)生長激素、胰高糖素等其它升糖激素的作用。4 h 無糖透析，患者丟失20 ～40 g 葡萄糖，造成人為饑餓狀態(tài)，血糖降低，為維持血糖穩(wěn)定，糖皮質(zhì)激素升高，G－組氫化可的松水平較高也與機(jī)體這一生理過程相符。石膽酸通過激活糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase，GP)和分解糖原［6］，也有維持血糖穩(wěn)定的作用。G+組氫化可的松、石膽酸水平較低，提示使用含糖透析液較使用無糖透析液患者體內(nèi)血糖穩(wěn)定，糖異生及糖原分解水平可能低于無糖透析。結(jié)合透后PCA 得分圖，含糖透析組DN 患者代謝狀態(tài)組內(nèi)差異小，代謝水平穩(wěn)定。

Figure 6. The identification procedure of differential metabolites at retention time (RT)28.25 min.A:the mass spectrum at RT 28.25 min;B:the MS/MS spectrum of ion of M/Z 377.3050 at 28.25 min in plasma sample;C:the formula and possible fragment mechanism of lithocholic acid.圖6 保留時(shí)間28.25 min 處差異代謝物的鑒定

天冬氨酸作為能量物質(zhì)可以通過糖異生轉(zhuǎn)化為葡萄糖，亦是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)［7］。有實(shí)驗(yàn)顯示血漿氨基酸水平有可能間接反映顱內(nèi)氨基酸水平［8-9］。大腦不能合成葡萄糖，且糖原儲量極少，血糖降低，神經(jīng)細(xì)胞供能不足，致神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞去極化，天冬氨酸釋放增加，再攝取減少，使N-甲基-天冬氨酸受體過度興奮，引起離子通道病理性開放、鈣離子大量內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，嚴(yán)重時(shí)造成細(xì)胞中毒死亡［10］。G+組血清天冬氨酸含量較G－組低，可能與使用含糖透析液較使用無糖透析液患者體內(nèi)血糖穩(wěn)定、糖異生降低、蛋白分解少有關(guān)，也提示使用含糖透析液患者顱內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平可能較低，對患者腦細(xì)胞可能有潛在保護(hù)作用。

體外紅細(xì)胞孵育實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)N-甲基煙酰胺呈劑量依賴性促進(jìn)紅細(xì)胞過氧化氫生成，降低紅細(xì)胞NAD/NADH 比值，提示N-甲基煙酰胺與氧化應(yīng)激有關(guān)［11］。G+組N－甲基煙酰胺升高，提示使用含糖透析液可能不利于降低DN 維持性血透患者體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài);二羥基前列腺素F 在人體內(nèi)的生物學(xué)功能尚不明確。8-異前列腺素F2α是前列腺素F2α的異構(gòu)體，可作為衡量機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)［12］，G+組二羥基前列腺素F 升高是否進(jìn)一步提示含糖透析加重DN 維持性血透患者體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，有待進(jìn)一步研究。

本研究利用代謝組學(xué)的研究方法，初步分析單次使用含5.5 mmol/L 葡萄糖透析液與無糖透析液血液透析4 h 后DN 維持性血透患者的代謝特征。使用含糖透析液較無糖透析液患者體內(nèi)血糖及代謝水平穩(wěn)定，減少糖異生水平，可能對于改善患者營養(yǎng)狀態(tài)具有優(yōu)勢，同時(shí)可能對透析患者腦細(xì)胞有潛在保護(hù)作用，但目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看可能有加重患者氧化應(yīng)激狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果亦顯示，將代謝組學(xué)及其技術(shù)運(yùn)用于對含糖透析血清全體代謝物的水平上綜合評價(jià)是可行的，使用含糖透析液對DN 維持性血透患者代謝的影響及意義還有待深入研究。

表2 含糖透析組與無糖透析組有顯著差異的代謝物Table 2. The differential metabolites between G + group and G － group (n=10)

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