秦 靜， 趙銘山， 李 君

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東 濱州256603)

肺纖維化是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，預(yù)后極差，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，5 年生存率＜50%，中位生存期為2.8 年［1］，目前臨床上仍以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑及細(xì)胞毒性藥物為主，但療效均不理想，且具有明顯的毒副作用［2］。近期研究發(fā)現(xiàn)丹參素(Danshensu，DA;即3，4-二羥基苯基乳酸，3，4-dihydroxyphenylacetic acid)能夠增加肺組織超氧化物歧化酶活性，減少丙二醛、羥脯氨酸含量，對(duì)肺纖維化有一定的干預(yù)作用，而且尚未發(fā)現(xiàn)丹參素對(duì)人體有明顯的不良反應(yīng)［3］，因此本研究利用博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型進(jìn)一步來(lái)觀察丹參素對(duì)肺纖維化的干預(yù)作用以及相關(guān)細(xì)胞因子的改變。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠40 只，體重(200 ±10)g，購(gòu)于山東綠葉制藥有限公司，飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物與試劑 博萊霉素(每支15 mg，日本化藥株式會(huì)社，批號(hào)為201560)，地塞米松(dexamethasone，DXM)磷酸鈉注射液(每支5 mg，濟(jì)南利民制藥，批號(hào)為11011115)，注射用丹參素鈉(每支150 mg，山東綠葉制藥，批號(hào)為050208)，Masson 染色試劑盒(南京建成)，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，Maxima SYBR Green/Rox qPCR Master Mix (Fermentas)，兔抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(Sigma)，二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋)。

1.3 主要儀器 病理圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics)，PCR 擴(kuò)增儀(Perkin Elmer，9600 型)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(澳大利亞Corbett，Rotor Gene 3000 型)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立、分組與標(biāo)本處理 按隨機(jī)數(shù)字表法將40 只SD 大鼠分為4 組，每組10 只。其中3 組為博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型組，參照Thrall 等報(bào)道的方法將博萊霉素5 mg·kg-1氣管內(nèi)一次性滴注復(fù)制大鼠肺纖維化模型，分為BLM 組、DXM 組和DA 組;另一組為正常對(duì)照(normal control，NC)組，同時(shí)間按同樣方法氣管內(nèi)滴注0.2 mL 生理鹽水。次日起，DA 組和DXM 組大鼠分別腹腔注射丹參素15 mg·kg-1·d-1和地塞米松1 mg·kg-1·d-1，BLM組和NC 組腹腔注射0.2 mL·d-1生理鹽水。所有動(dòng)物于造模后第28 天解剖分離肺組織，右肺置于4%多聚甲醛固定后制備4 μm 石蠟切片供病理學(xué)檢查(HE 染色及Masson 染色)及免疫組化，左肺組織投入液氮中保存。

2.2 肺組織病理學(xué)改變 HE 染色評(píng)定肺組織肺泡炎程度，Masson 染色評(píng)定肺組織纖維化程度。行常規(guī)HE 染色及Masson 染色。Masson 染色操作嚴(yán)格按照Masson 染色試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，藍(lán)色的膠原纖維為陽(yáng)性染色，并用Image-Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)采集肺組織Masson 染色圖像，隨機(jī)取染色區(qū)域6 個(gè)高倍視野(×100)，測(cè)量并記錄每個(gè)視野陽(yáng)性染色的面積(μm2)進(jìn)行半定量分析。

2.3 免疫組織化學(xué)測(cè)定肺組織α-SMA 表達(dá) 按即用型免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)(SP 法)操作。常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，正常山羊血清封閉;Ⅰ抗:兔抗鼠α-SMA 單克隆抗體(1∶400);Ⅱ抗:生物素化山羊抗兔IgG;DAB 顯色;常規(guī)蘇木素復(fù)染;脫水、透明、封片。用PBS 代替Ⅰ抗進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果作為陰性對(duì)照。使用Image-Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)采集肺組織免疫組織化學(xué)圖像，將肺組織各切片隨機(jī)取染色區(qū)域6 個(gè)高倍視野(×400)，測(cè)量并記錄每個(gè)視野陽(yáng)性染色的平均積分吸光度(IA)。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測(cè)定轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1) 、Smad3 及Smad7 mRNA 的表達(dá) 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。TGF-β1上游引物5'-ctgctgacccccactgatac-3'，下游引物5'-ctgtattccgtctccttggttc-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度90 bp;Smad3 上游引物5'-gctttgaggctgtctaccagtt-3'，下游引物5'-tccctttactcccagtgtctct-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度233 bp;Smad7 上游引物5'-tgctgtgcaaagtgttcaggtg-3'，下游引物5'-ccatcgggtatctggagtaagga-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度177 bp;β-actin 上游引物5'-gagagggaaatcgtgcgtgac-3'，下游引物5'-catctgctggaaggtggaca-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度453 bp。TRIpure 試劑提取大鼠肺組織總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再以cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件:95℃10 min ，1 個(gè)循環(huán);95 ℃15 s ，60 ℃60 s，40 個(gè)循環(huán)。PCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)定量方法，用內(nèi)參照β-actin 作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算方法選擇2-ΔΔCt法。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，組間均值比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺組織病理學(xué)改變

HE 染色結(jié)果顯示，NC 組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)輪廓完整清晰，肺泡壁薄而光滑，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);BLM 組大片肺泡結(jié)構(gòu)破壞或萎陷，肺泡間隔明顯增厚，形成多發(fā)片狀實(shí)變，實(shí)變組織內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);DXM 組部分肺泡結(jié)構(gòu)塌陷，肺泡間隔增厚，炎癥較NC 組嚴(yán)重，但較BLM 組明顯減輕;DA 組肺泡結(jié)構(gòu)仍存在，肺泡間隔增厚不明顯，炎癥較BLM組和DXM 組均明顯減輕，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Histopathological changes of lung tissues of rats in each group (HE staining，×100).圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變

Masson 染色結(jié)果顯示，NC 組肺血管壁和氣管周圍及肺泡間隔可見(jiàn)少量藍(lán)色的膠原纖維沉積，為肺間質(zhì)的正常組成成分;BLM 組肺血管壁、支氣管壁和肺泡間隔均可見(jiàn)大量片狀或束狀的膠原纖維沉積，并可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原沉積于肺泡腔，形成典型的間質(zhì)纖維化改變，與NC 組比有顯著差異(P ＜0.01);DXM 組肺血管壁與支氣管壁的膠原纖維主要表達(dá)在肌層下，肺泡間隔膠原纖維表達(dá)較BLM 組顯著減少(P ＜0.05);DA 組肺組織也有藍(lán)染的膠原纖維表達(dá)，較BLM 組顯著減少(P ＜0.01)，較DXM組也顯著減少(P ＜0.01)，見(jiàn)圖2。4 組大鼠陽(yáng)性染色面積的比較見(jiàn)表1。

Figure 2. Collagen deposition of lung tissues of rats in each group (Masson staining，×100).圖2 各組大鼠肺組織膠原沉積

2 肺組織α-SMA 表達(dá)

免疫組化結(jié)果以細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為α-SMA 陽(yáng)性顯色。NC 組肺組織的較大血管平滑肌和氣道平滑肌偶見(jiàn)α-SMA 陽(yáng)染細(xì)胞;BLM 組肺組織可見(jiàn)大量α-SMA 陽(yáng)染細(xì)胞，形成典型的成纖維細(xì)胞灶，與NC 組有顯著差異(P ＜0.01);DXM 組肺組織仍可見(jiàn)成纖維細(xì)胞灶存在，但α-SMA 陽(yáng)染細(xì)胞較BLM 組明顯減少(P ＜0.05);DA 組肺組織未見(jiàn)成纖維細(xì)胞灶，α-SMA 陽(yáng)染細(xì)胞較BLM 組明顯減少(P ＜0.01)，較DXM 組也明顯減少(P ＜0.05)，見(jiàn)圖3。各組IA 值比較見(jiàn)表1。

3 肺組織TGF-β1、Smad3 和Smad7 mRNA 的表達(dá)

BLM 組TGF-β1和Smad3 mRNA 的表達(dá)顯著高于NC 組(均P ＜0. 01);DA 組TGF-β1和Smad3 mRNA 的表達(dá)較BLM 組顯著降低(均P ＜0.01)，但較NC 組升高(均P ＜0.05)。BLM 組Smad7 mRNA的表達(dá)顯著低于NC 組(P ＜0. 01);DA 組Smad7 mRNA 的表達(dá)較BLM 組顯著升高(P ＜0.01)，但仍低于NC 組(P ＜0.01)，見(jiàn)表2。

Figure 3. Immunohistochemical staining of α-SMA in lung tissues of rats in each group (×400).圖3 各組大鼠肺組織α-SMA 的免疫組化染色

表1 各組大鼠肺組織膠原纖維面積和肺組織α-SMA 蛋白表達(dá)的比較Table 1. Area of collagen and expression of α-SMA protein in lung tissues of rats in each group (mean±SD.n=18)

討 論

丹參素是從丹參水提液中分離得到的一種有效成分，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于對(duì)肝纖維化的研究。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示丹參素對(duì)肝纖維化有明顯的治療作用［4］，但對(duì)肺纖維化形成階段的治療作用及其機(jī)制尚未完全清楚。本研究通過(guò)博來(lái)霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型后，在肺纖維化形成階段給予丹參素進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參素可減輕大鼠肺泡炎和肺纖維化的嚴(yán)重程度，表明丹參素具有抗肺纖維化形成的作用，有可能成為新的抗肺纖維化的藥物，但還需要進(jìn)一步研究。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3 和Smad7 mRNA 的表達(dá)Table 2. The mRNA expression of TGF-β1，Smad3 and Smad7 in lung tissues of rats in each group (mean±SD.n=9)

成纖維細(xì)胞灶是特發(fā)性肺纖維化的主要病理學(xué)特征之一［5］。成纖維細(xì)胞灶主要由肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts，MFb)構(gòu)成，其合成膠原纖維的能力是成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)b)的4 ～5 倍，是造成細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積的主要效應(yīng)細(xì)胞［6］。由于α-SMA是Fb 向MFb 轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白［7］，因此對(duì)α-SMA蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)可以間接地反映MFb 的增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，α-SMA 在DA 組大鼠肺組織中的表達(dá)水平較BLM 組顯著降低，表明丹參素能夠阻止以表達(dá)α-SMA 為主的MFb 形成，從而減緩大鼠肺纖維化的形成。

在眾多致纖維化細(xì)胞因子中，TGF-β1被公認(rèn)是最重要的調(diào)控因子，有研究表明TGF-β1mRNA 在肺纖維化大鼠肺組織中明顯升高［8］。TGF-β1能刺激未成熟成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)Fb 遷移、增殖，誘導(dǎo)Fb 表型轉(zhuǎn)換為MFb，繼而促進(jìn)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)和肺泡間過(guò)度積聚，從而導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1mRNA 在DA組肺組織中的表達(dá)程度較BLM 組顯著降低，提示丹參素的抗纖維化作用可能部分是通過(guò)抑制TGF-β1進(jìn)而減少肺組織中表達(dá)α-SMA 的肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

TGF-β1的致肺纖維化效應(yīng)主要通過(guò)Smads 信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smads 是TGF-β1與其細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后的胞內(nèi)激酶底物，介導(dǎo)了TGF-β1的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中Smad3 促進(jìn)纖維化的形成，Smad7 卻是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要抑制性蛋白［10］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇Smad3 和Smad7 為觀察指標(biāo)，初步探討丹參素抗纖維化作用的可能機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，BLM 組大鼠肺組織中Smad3 mRNA 表達(dá)升高，Smad7 mRNA 表達(dá)降低，提示博萊霉素可能激活了TGF-β1/Smads 信號(hào)通路，從而使肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化;經(jīng)丹參素干預(yù)后，大鼠肺組織Smad3 mRNA 表達(dá)下調(diào)，而Smad7 mRNA 上調(diào)，提示丹參素可能通過(guò)影響成纖維細(xì)胞Smad3 和Smad7 mRNA 的表達(dá)，抑制TGF-β1/Smads 信號(hào)途徑，從而發(fā)揮抗肺纖維化作用。

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