葉志強， 戴海濤， 劉旭輝， 曾 花， 邢幫榮， 陳銳涵， 衛(wèi)洪波

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1急診科，2胃腸外科，廣東 廣州510630)

各種原因?qū)е陆M織器官缺血時，會引起細胞代謝障礙和組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞，而當(dāng)血供恢復(fù)時，組織及細胞損傷反而出現(xiàn)加重的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)。微血管通透性增加、組織間質(zhì)水腫、血管調(diào)節(jié)機制受損及炎癥細胞浸潤與缺血再灌注所引發(fā)的器官功能障礙相關(guān)。小腸是對缺氧缺血最敏感的器官之一。腸缺血再灌注損傷是一個臨床很常見問題，常繼發(fā)于腸扭轉(zhuǎn)、腸系膜靜脈血栓形成以及嚴(yán)重的燒傷、創(chuàng)傷、感染、休克等病理狀態(tài)。缺血再灌注損傷引起小腸局部微血管通透性增加、腸黏膜屏障功能受損，從而導(dǎo)致腸道細菌和毒素的移位，進而引起大量氧自由基產(chǎn)生和炎癥介質(zhì)的釋放，嚴(yán)重時可引發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征［1］。因此，防治腸缺血再灌注損傷是危重病研究領(lǐng)域的重點之一。氧化應(yīng)激是腸缺血再灌注導(dǎo)致組織損傷的關(guān)鍵過程，因此抗氧化是防治腸缺血再灌注損傷的重要方法。氫氣作為一種抗氧化氣體，已被證實能減輕多種組織的缺血再灌注損傷，而乳果糖(lactulose)能被定植在胃腸道的菌群分解，氫氣是該過程的主要副產(chǎn)物［2］。作為體內(nèi)氫氣的重要來源，乳果糖是否能減輕腸缺血再灌注損傷?因此本研究在構(gòu)建大鼠腸缺血再灌注損傷模型基礎(chǔ)上，觀察了乳果糖預(yù)處理對腸缺血再灌注損傷的影響及作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

Lactulose 購自Sigma，cleaved caspase-3 抗體(CST9664)和GAPDH 抗體(CST2118)均購自Cell Signaling Technology，Bradford 蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和HE 染色試劑盒均購自廣州永諾生物科技有限公司，TUNEL 試劑盒購自Roche，Hoechst 33258 購自Invitrogen，白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA、IL-1β ELISA 和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA 試劑盒均購自R＆D，丙二醛(malondialdehyde，MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

2 方法

2.1 實驗設(shè)計及腸缺血再灌注模型 將30 只SD大鼠(購自中山大學(xué)實驗動物中心)隨機分為3 組，每組10 只，分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和乳果糖灌胃預(yù)處理組。乳果糖組手術(shù)前7 d 每天進行乳果糖灌胃(濃度0.1 kg/L，10 mL/kg)，假手術(shù)組及缺血再灌注組給予等體積的生理鹽水灌胃。手術(shù)前晚禁食，10%水合氯醛4 mL/kg 腹腔注射麻醉SD 大鼠(7～8 周，250 ～300 g)后，經(jīng)腹部正中切口，分離腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)，sham 組只分離腸系膜上動脈，然后縫合腹部切口;IR 組及l(fā)actulose 組分離腸系膜上動脈后，用微動脈夾夾閉，縫合切口，30 min 后經(jīng)原切口進腹，取出動脈夾，恢復(fù)血供，持續(xù)再灌注60 min。腸系膜上動脈夾閉成功的標(biāo)志為微動脈夾夾閉后腸管立即收縮、腸壁變蒼白、腸系膜上動脈搏動消失，開放血管后搏動恢復(fù)，腸壁出現(xiàn)充血。

2.2 樣本采集 再灌注模型完成立即經(jīng)原切口開腹，sham 組、IR 組及l(fā)actulose + IR 組取股靜脈血1 mL，室溫靜置30 min 使血液凝固，4 ℃、1 000 ×g 離心10 min 分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取距盲腸約10 cm 小腸組織4 cm，分成3 份，1 份組織用4%PFA固定，石蠟包埋切片，HE 染色觀察小腸組織形態(tài)的改變，TUNEL 熒光染色評估細胞凋亡情況;其余2 份置液氮中凍存，采用Western blotting 檢測cleaved caspase-3 表達水平，并檢測小腸組織中MDA 及SOD水平。

2.3 腸黏膜形態(tài)學(xué)觀察 HE 染色后，光鏡下觀察腸黏膜組織形態(tài)學(xué)改變，采用Chiu's 評分法評價腸黏膜損傷程度，評分高，表明損傷嚴(yán)重。

2.4 免疫印跡( Western blotting) 100 mg 小腸組織用500 μL RIPA 裂解液裂解后，勻漿，4 ℃、16 000 ×g 離心取上清，采用Bradford 方法進行蛋白定量，煮沸樣本5 min，冰上冷卻后10 000 ×g 離心30 s，取上清進行SDS-PAGE，然后100 V 轉(zhuǎn)膜1 h，0. 5%(W/V)脫脂牛奶室溫封閉PVDF 膜1 h，4 ℃Ⅰ抗孵育過夜，0.1%(V/V)TBST 洗膜2 次后，室溫孵育Ⅱ抗1 h ，洗膜3 次后即用ECL 顯色曝光。

2.5 原位凋亡檢測 采用原位末端標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)，石蠟切片脫蠟水化后用20 mg/L 蛋白酶K 室溫處理30 min，PBS 清洗后在樣品上加50 μL 標(biāo)記液，37 ℃避光孵育60 min，清洗后用Hoechst 33258 染核，封片后用熒光顯微鏡觀察。計數(shù)陽性細胞數(shù)(綠色)和總細胞數(shù)(藍色)，計算凋亡指數(shù)(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))。

2.6 其它生化指標(biāo)檢測 血清中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平采用ELISA 檢測，小腸組織中MDA 和SOD 水平檢測嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS 軟件包進行統(tǒng)計處理，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乳果糖預(yù)處理對缺血再灌注腸組織的保護作用

假手術(shù)組腸絨毛結(jié)構(gòu)完整;缺血再灌注組可見顯著的組織損傷，腸絨毛剝脫，間質(zhì)出血，大量炎癥細胞浸潤;乳果糖預(yù)處理組病變較缺血再灌注組顯著減輕，見圖1。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組Chiu's 評分顯著升高(P ＜0.05)，乳果糖預(yù)處理組與缺血再灌注組比較，Chiu's 評分顯著降低(P ＜0.05)，見表1。

Figure 1. Effect of lactulose preconditioning on the histopathological changes of the intestine in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury (HE staining，×200).圖1 乳果糖預(yù)處理對缺血再灌注損傷誘導(dǎo)小腸組織病理改變的影響

表1 各組大鼠腸黏膜組織Chiu's 評分及凋亡指數(shù)的比較Table 1. Changes of Chiu's score and enterocyte apoptotic index(mean±SD.n=10)

2 乳果糖預(yù)處理抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的腸上皮細胞凋亡。

假手術(shù)組未見明顯凋亡，缺血再灌注組TUNEL陽性細胞數(shù)顯著增加，而乳果糖預(yù)處理組凋亡細胞數(shù)顯著低于缺血再灌注組，見圖2。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組凋亡指數(shù)顯著升高(P ＜0.05)，乳果糖預(yù)處理組與缺血再灌注組比較，凋亡指數(shù)顯著降低(P ＜0.05)，見表1。

與假手術(shù)組比，缺血再灌注損傷誘導(dǎo)激活型caspase-3 上調(diào)，而乳果糖預(yù)處理對激活型caspase-3上調(diào)有抑制作用，見圖3。以上兩個方面的結(jié)果表明乳果糖預(yù)處理對缺血再灌注誘導(dǎo)的細胞凋亡有保護作用。

3 乳果糖預(yù)處理能抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的血清炎癥因子水平上升

假手術(shù)組、缺血再灌注組及乳果糖預(yù)處理組IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平有明顯改變，見圖4。缺血再灌注誘導(dǎo)血清中炎癥因子顯著上升，而乳果糖預(yù)處理對腸缺血再灌注大鼠血清中炎癥因子有部分抑制作用。

4 乳果糖預(yù)處理抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

假手術(shù)組、缺血再灌注組及乳果糖預(yù)處理組MDA 和SOD 水平有明顯改變，見圖5。

Figure 2. Effect of lactulose preconditioning on the apoptosis of small intestine in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury (TUNEL，×200).圖2 乳果糖預(yù)處理對缺血再灌注損傷誘導(dǎo)小腸上皮細胞凋亡的影響

Figure 3. Inhibition of cleaved caspase-3 expression by lactulose preconditioning in the intestine of rats with intesinal ischemia-reperfusion (IR)injury. Mean ± SD. n =10.* P ＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs IR group.圖3 乳果糖預(yù)處理抑制激活型caspase-3 上調(diào)

討 論

缺血再灌注損傷是創(chuàng)傷、嚴(yán)重感染及休克等疾病共同存在的病理生理過程，可導(dǎo)致許多嚴(yán)重并發(fā)癥［2］。小腸是對缺血再灌注損傷最敏感的器官之一，在腸絞窄、小腸移植和腸系膜血管缺血性疾病等情況下，均會造成小腸的缺血性損傷，在組織恢復(fù)血供時，再灌注損傷會加重對小腸的損傷。許多研究報道，小腸是機體最大的細菌庫，缺血再灌注損傷消化道，削弱小腸的生理屏障功能，可以導(dǎo)致腸內(nèi)細菌移位，激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，引起大量炎癥因子的釋放，誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合癥和多器官功能不全綜合癥的發(fā)生。

隨著研究的不斷進步，人們對腸缺血再灌注損傷的發(fā)生機制有了更深入的認(rèn)識?；钚匝醮?ROS)是由氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的、在分子組成上含有氧、化學(xué)性質(zhì)非常活潑的一類物質(zhì)的總稱?；钚匝醮氐倪^量生成是導(dǎo)致小腸缺血再灌注損傷的一個重要機制［3］。小腸組織對缺血再灌注損傷敏感，是由于小腸絨毛富含活性氧簇相關(guān)的酶，缺血再灌注激活了腺嘌呤-次黃嘌呤代謝途徑，使氧自由基的產(chǎn)生異常增加，消耗內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)如SOD，并攻擊富含不飽和脂肪酸的細胞膜、線粒體膜等膜性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，損傷生物膜，此外，蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子也會受到氧自由基攻擊。MDA 是反映脂質(zhì)過氧化水平的一個良好標(biāo)記物。大量文獻報導(dǎo)，缺血再灌注時SOD 活性下降，MDA 顯著增高，本研究在誘導(dǎo)小腸缺血再灌注發(fā)生后，同樣在小腸組織中檢測到SOD 活性下降和MDA 水平的異常升高，表明模型誘導(dǎo)成功。

Figure 4. Effects of lactulose preconditioning on the serum levels of IL-6，TNF-α and IL-1β in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury.Mean±SD. n=10. * P ＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs IR group.圖4 乳果糖預(yù)處理對腸缺血再灌注損傷大鼠血清IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平的影響

Figure 5. Effects of lactulose preconditioning on the levels of MDA and SOD in the intestine of rats with intestinal ischemia-reperfusion injury.Mean±SD. n=10. * P ＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs IR group.圖5 乳果糖預(yù)處理對腸缺血再灌注損傷大鼠腸組織MDA 和SOD 水平的影響

生理情況下，細胞凋亡是一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，是機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主有序的死亡過程。但在病理情況下，細胞發(fā)生過度凋亡則會造成組織結(jié)構(gòu)及功能的破壞［4］。多個研究報道，缺血再灌注損傷能造成多種組織器官細胞過度凋亡，從而造成組織損傷［5-8］。Ikeda 等［9］研究表明細胞凋亡是缺血再灌注損傷引起小腸絨毛上皮細胞死亡的主要形式，凋亡細胞數(shù)約占細胞死亡總數(shù)的80%。過度的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及菌群移位可能與細胞凋亡相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組對比，缺血再灌注導(dǎo)致小腸上皮細胞TUNEL 陽性細胞數(shù)顯著升高，而且主要發(fā)生在小腸絨毛的頂部。

基于以上研究，通過抑制氧化應(yīng)激保護缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡，是治療腸缺血再灌注損傷的一種策略。乳果糖是人工合成的一種糖類，是由一分子果糖和一分子乳糖形成的雙糖，常用于治療便秘和肝性腦病。乳果糖不能由人體吸收，但可以由定植在結(jié)腸的細菌分解，主要副產(chǎn)物之一是氫氣，口服乳果糖能顯著提高氫氣的產(chǎn)率［10］。研究報道乳果糖對DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎有一定的保護作用，氫氣在這個過程中可能起到關(guān)鍵作用，乳果糖能劑量依賴性保護DSS 誘導(dǎo)的小腸組織損傷，MPO 活性、脂質(zhì)過氧化及組織炎癥也同時受到抑制［11-12］。在本研究中，我們觀察到預(yù)先給予大鼠乳果糖灌胃處理后，能保護缺血再灌注誘導(dǎo)的小腸上皮細胞損傷，抑制小腸上皮細胞凋亡，對炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β 的水平有抑制作用，降低MDA 生成的同時提高小腸組織SOD 水平。氫氣的產(chǎn)生在乳果糖對缺血再灌注的保護過程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，這方面的研究需要進一步證實。

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