宋發(fā)軍，黃宗華

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

七葉一枝花(Parispolyphyllavar.chinensis)又名華重樓、蚤休等，是延齡草科(Trilliaceae)重樓屬(Paris)多年生草本植物.最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中是以蚤休之名記載[1].七葉一枝花的野生資源匱乏，且七葉一枝花的種子成熟時(shí)，其未分化的胚停留在原胚階段,有“二次休眠”的特性，需要2個(gè)低溫和2個(gè)高溫才能打破休眠，出苗困難，種子從繁殖到藥用一般需要5～10年，急需尋找一種解決種子出苗困難問題的辦法[2-4]，雖然種子繁殖技術(shù)復(fù)雜，生長周期長，但繁殖系數(shù)大，故種子的快速萌發(fā)研究得到了廣泛關(guān)注.

研究表明，楊麗云等[5]用云南重樓的芽作外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得組培苗，但不能用于大田生產(chǎn)；李群等[6]用根莖為外植體，愈傷組織的誘導(dǎo)效果不理想；熊海浪等[7，8]用剝離了滇重樓種子的胚乳和子葉進(jìn)行組織培養(yǎng)，只在光照下才能生長.王艷芳等[9]選擇成熟果實(shí)的種子、去除種皮和用赤霉素處理，可提高滇重樓種子發(fā)根率和發(fā)根速度.目前人們最為關(guān)注的是七葉一枝花不同外植體的組織培養(yǎng)，因?yàn)樵诙唐趦?nèi)可以獲得大量種苗.本文主要從植物組織培養(yǎng)和七葉一枝花種子快速萌發(fā)兩方面來研究，而種子的萌發(fā)以胚根長短及其萌發(fā)率為指標(biāo)，研究溫度、赤霉素、外源激素等對七葉一枝花種子對種子萌發(fā)過程的影響.

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

超凈工作臺(tái)(SWC-J-A智能型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，恒溫箱培養(yǎng)箱(SPX-250BS-II型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，冰箱(BCD-277(KK28F76TI)型，博西華家用電器有限公司).

MS培養(yǎng)液(上?？婆d貿(mào)易有限公司)，2,4-D和NAA(上海科興生化試劑有限公司)、 6-BA(上海拜力生物科技有限公司)、GA3(Sigma公司)，PEG 6000(上海索誠化學(xué)試劑有限公司).

1.2 材料

2011年2月末，從恩施土家族苗族自治州神農(nóng)架林區(qū)移栽帶頂芽的七葉一枝花根狀莖，種植于小缽子內(nèi).栽植時(shí)芽頭向上，用手輕壓根狀莖入疏松的腐殖質(zhì)土內(nèi)，其上覆蓋一薄層苔蘚保持濕潤，第一次澆透水，置于氣候光照培養(yǎng)箱內(nèi)供實(shí)驗(yàn)使用.3月，七葉一枝花開始長出苗，每年的秋末冬初季節(jié)，七葉一枝花開始倒苗，第2年又重新長出新的地上部分.

2011年9月末，從云南大理采集新鮮的七葉一枝花成熟種子，經(jīng)劉學(xué)群教授鑒定后置于冰箱的密封塑料袋內(nèi)使其腐爛，并用水流強(qiáng)的自來水洗去穎殼，再用手搓揉種子外種皮并用細(xì)孔篩篩去紅色漿果的外種皮，余下白色種子，晾干后人工去除殘留物，4℃保存?zhèn)溆肹10].

1.3 方法

1.3.1 外植體的消毒與無菌外植體的獲得

選取飽滿的種子和當(dāng)年的地下根莖為外植體，從頂芽下的第2和第3莖痕間切斷根莖，帶頂芽的繼續(xù)留作種苗，其余的則留作外植體，用自來水大流速?zèng)_洗根狀莖2～3 h(種子用蒸餾水浸泡24 h)，然后進(jìn)行無菌操作：用無菌水清洗外植體3～5次后置于75％的無水乙醇浸泡30 s，再用無菌水清洗3～5次，置于0.1％HgCl2浸泡根狀莖10～15min，種子12～15min，最后用無菌濾紙吸干表面的水分[11].

1.3.2 種子和根莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基

不同濃度激素組合下的七葉一枝花種子和根莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基如表1所示，將不同的激素配比下的培養(yǎng)基分別命名為A～G.

表1 不同濃度激素組合下的培養(yǎng)基

1.3.3 接種和培養(yǎng)

將種子接種在培養(yǎng)基A和B上，每個(gè)三角瓶接種3粒種子，共接種100粒種子，2個(gè)月時(shí)統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，2個(gè)月后將接種在A培養(yǎng)基上的種子換到B培養(yǎng)上繼續(xù)培養(yǎng).將根莖接種在培養(yǎng)基C、D、E、F和G上，每個(gè)三角瓶接種3塊，共接種100塊根狀莖.取七葉一枝花種子誘導(dǎo)出的較好的愈傷組織，分別接種于繼代培養(yǎng)基(與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同)上繼代培養(yǎng)，繼代1個(gè)月后，接種在預(yù)先配好的分化培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA)上分化培養(yǎng).

當(dāng)種子的胚根突破種皮后長到2～3 cm時(shí)，無菌條件下去除其胚乳部分，置于15～22℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(1000 μmol·m-2·s-1,12 h)和暗培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng).當(dāng)種子的胚根長到3～4 cm時(shí)，從尖端處向上切去胚根根尖約1～2 cm，種子長根的另一端切去部分種皮，繼續(xù)在相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和條件下培養(yǎng).

1.4 浸種處理和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用實(shí)驗(yàn)前的浸種處理，用不同濃度的GA3、6-BA、2,4-D和PEG 6000(如表2)對七葉一枝花的種子浸泡24 h，重蒸水作對照，放在20℃黑暗條件下.1 d后倒掉浸種的溶液，用自來水反復(fù)沖洗數(shù)次，直至洗凈殘留液體，再用蒸餾水和重蒸水沖洗5次，無菌下處理種子.

超凈工作臺(tái)內(nèi)用無菌水洗3～5次，75％酒精消毒30 s，0.1％升汞浸泡10～15 min，無菌水洗3～5次，在150 cm的2層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，滴加無菌水濕潤濾紙并封好培養(yǎng)皿，置于人工氣候培養(yǎng)箱(20±2)℃暗培養(yǎng)，每隔3～5 d觀察1次.若發(fā)現(xiàn)有輕微發(fā)霉的種子，用無菌水清洗后在放回原處；若發(fā)霉數(shù)量較多，則及時(shí)更換發(fā)芽濾紙.

以胚根的長度和萌發(fā)率來表示胚根的生長情況：最長胚根長度=規(guī)定日期內(nèi)胚根達(dá)到一定長度的種子，萌發(fā)率=胚根突破種皮時(shí)的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100％.

表2 不同濃度的GA3，2,4-D和PEG6000培養(yǎng)基組成

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA、NAA和2，4-D的不同濃度組合對種子和根莖愈傷組織的影響

將6-BA、NAA和2，4-D以表1中的不同濃度組合作為培養(yǎng)基培養(yǎng)種子和根莖，發(fā)現(xiàn)接種在A培養(yǎng)基上的種子胚根突破種皮的時(shí)間較B培養(yǎng)基短，萌發(fā)率較B 培養(yǎng)基高.由于接種在A培養(yǎng)基上的種子，細(xì)胞分裂素的濃度低于生長素的濃度，促進(jìn)根的形成；而B培養(yǎng)基細(xì)胞分裂素的濃度高，促進(jìn)芽的分化.在A培養(yǎng)基上還能誘導(dǎo)出愈傷組織，接種在B培養(yǎng)基上能分化出芽；而在B上則沒有誘導(dǎo)出愈傷組織.

接種在C、D、E、F和G培養(yǎng)基上的根狀莖，只在D上誘導(dǎo)出了愈傷組織，誘導(dǎo)率低，且未分化出苗，30瓶只有4瓶誘導(dǎo)出愈傷組織.原因是C培養(yǎng)基的細(xì)胞分裂素和生長素的濃度相差不大，不能起到協(xié)同促進(jìn)作用；而E培養(yǎng)基濃度相差過大，也未誘導(dǎo)出愈傷組織；D培養(yǎng)基比例濃度適合誘導(dǎo)出愈傷組織，但誘導(dǎo)率不高，說明還可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素和生長素的濃度，以誘導(dǎo)出更多的愈傷組織，進(jìn)而分化出苗.F和G生長素的濃度較細(xì)胞分裂素高，未誘導(dǎo)出愈傷組織，原因是相差2～4倍不能滿足要求，需要更大的倍數(shù)才能誘導(dǎo)出愈傷組織.

2.2 不同溫度、光照條件對根狀莖誘導(dǎo)效果的影響

植物組織的培養(yǎng)需要一定的溫度和光照.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在17～22℃誘導(dǎo)效果變化不大.相同溫度下12 h光照處理與暗培養(yǎng)的差別是：光照強(qiáng)度越大，愈傷粒(圖1)越壯大，顏色由泛白-白中帶黃點(diǎn)-淡黃-黃色逐漸加深，愈傷表面逐漸由干爽變?yōu)椴桓伤?，愈傷誘導(dǎo)率下降，這是由于光合作用可促進(jìn)生長，但光照強(qiáng)度過大使培養(yǎng)基內(nèi)水分蒸發(fā)，吸附在玻璃內(nèi)壁上，愈傷粒表面吸水，顏色變黃，誘導(dǎo)率降低.15℃也能使根狀莖誘導(dǎo)出愈傷組織，但誘導(dǎo)率不高且生長緩慢.實(shí)驗(yàn)中所取的根莖外植體多年生于土中，污染較嚴(yán)重.

圖1 根狀莖的愈傷組織

2.3 6-BA和NAA對種子誘導(dǎo)效果的影響

6-BA和NAA對種子誘導(dǎo)效果的影響見圖2.由圖2中有的直接誘導(dǎo)出愈傷組織(圖2a)；有的誘導(dǎo)出愈傷組織還同時(shí)長出芽(圖2b)；有的培養(yǎng)一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，愈傷組織不斷褐化甚至變黑(圖2c)；有的未分化出苗，但芽不斷地長大，最后分化出莖和子葉，根狀莖也在不斷地膨大加粗，60 d后膨大的根莖處開始分化出第2個(gè)芽(圖2d).

a)種子的愈傷組織；b)種子的愈傷組織和芽；c)愈傷組織變黑，芽逐漸分化；d)根狀莖分化出第2個(gè)芽

2.4 不同處理后種子培養(yǎng)結(jié)果分析

切去根尖尖端1～2 cm后，發(fā)現(xiàn)約2個(gè)月時(shí)在其切口部位長出一個(gè)膨大的圓形的突起(見圖3)，再將其膨大的部位縱橫各切1刀得4塊組織繼續(xù)培養(yǎng).1個(gè)月后，在其中的1塊膨大的部位上分化出1團(tuán)薄壁細(xì)胞.種子長根的另一端切去部分種皮，發(fā)現(xiàn)有子葉伸出，但一段時(shí)間后不再變化，由于當(dāng)胚根出現(xiàn)時(shí)，子葉并未立即出現(xiàn)，說明七葉一枝花存在“上胚軸休眠”現(xiàn)象，胚根生長比子葉和胚軸更快，子葉的分化和發(fā)育最慢.

圖3 根尖長出膨大的突起

去掉胚乳的帶胚根的種子培養(yǎng)一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)要分化出子葉的那一部位漸漸枯萎，最后死掉.由于去掉了胚乳的養(yǎng)分后，培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)不能滿足其生長的要求，或因激素的濃度和蔗糖的滲透調(diào)節(jié)性不佳，不能促其生長而最終死掉；或因光照大，導(dǎo)致光合作用強(qiáng)，水分蒸發(fā)快，使其缺少水分而漸漸枯萎死掉.

2.5 種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)

不同GA3，2,4-D和PEG6000配比下對種子萌發(fā)率的影響結(jié)果見表3.由表3可知，GA3能不同程度地誘導(dǎo)胚根長出，2個(gè)月時(shí)除去爛掉和染菌的的種子，種子的發(fā)芽率都很高；2個(gè)月時(shí)2 mg/L 2,4-D (7號)對種子的發(fā)芽率有抑制作用，低于6號和8號而35％的PEG6000(10號)的發(fā)芽率比9號和11號高，說明低濃度的PEG對種子引發(fā)的效果沒有高濃度效果好，且整齊度高.

表3 不同GA3，2,4-D和PEG6000配比對種子萌發(fā)率的影響

3 討論

在對七葉一枝花的組織培養(yǎng)中，影響種子誘導(dǎo)率的條件有成熟種子的預(yù)處理的方法、培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)條件和細(xì)胞分裂素和生長素等.選擇合適的外植體和植物激素是體外增殖的重要因素，而植物組織培養(yǎng)的目的即降低繁殖的時(shí)間增加植物的數(shù)量.培養(yǎng)根狀莖一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)：在根狀莖的外植體上有不同程度的污染現(xiàn)象，由于有內(nèi)生真菌的存在，在培養(yǎng)的初期，內(nèi)生真菌未立刻顯現(xiàn)出來，在繼代過程中，潛伏的內(nèi)生菌不斷出現(xiàn)，污染材料導(dǎo)致誘導(dǎo)率下降，可考慮在培養(yǎng)基加抗生素或消毒液中加Tween-20.

在30 mg/L GA3萌發(fā)率最高，故可考慮加大濃度，尋找一個(gè)使種子萌發(fā)更高的最低的GA3的濃度.PEG是較為理想的滲透劑，它是一種高分子惰性物質(zhì)，有各種分子量類型，在種子處理時(shí)分子量 6000～10000，濃度以20％～30％為佳.PEG在大豆、高粱、水稻、菠菜、花生等作物種子處理上都表現(xiàn)出明顯效果，特別是活力低的種子經(jīng)處理后活力明顯提高.應(yīng)用 PEG處理種子時(shí)，要通過預(yù)試驗(yàn)摸索最佳的劑量、溫度和時(shí)間等條件，然后在大田中應(yīng)用.后續(xù)實(shí)驗(yàn)還可考慮用PEG8000、PEG10000和PEG20000對七葉一枝花的種子進(jìn)行處理，獲得更高的萌發(fā)率和幼苗整齊度，并檢測激素含量的變化和發(fā)生這種變化的機(jī)制.野生七葉一枝花具有廣闊的應(yīng)用前景，應(yīng)用植物組織培養(yǎng)能解決其培養(yǎng)過程中的某些問題，也可推動(dòng)我國中藥材的發(fā)展和進(jìn)步.

[1]張 嫚,李彥文,李志勇，等.重樓屬藥用植物的研究進(jìn)展[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2011,4(2):145-148.

[2]陳 偉,馬紹賓,陳宏偉.生境對滇重樓種子發(fā)育與萌發(fā)的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,50(5): 972-974.

[3]黃 瑋,孟繁蘊(yùn),張文生，等.滇重樓種子休眠機(jī)理研究[J].植物生理科學(xué),2008,24(12):242-246.

[4] Ye Y,Chen S,Wang L,et al.Effects of stratification at different temperatures on the embryo differentiation and development ofparispolyphyllavar.yunnanensis seeds[J].Pak J Bot,2011,43(3):1507-1512.

[5]楊麗云,陳 翠,呂麗芬，等.云南重樓的組織培養(yǎng)與植株再生[J].植物生理學(xué)通訊,2008,44(5):947-948.

[6]李 群,陳麗萍,葛方蘭.重樓屬植物愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)[J].四川師范大學(xué)學(xué)報(bào),2006,29(1):120-122.

[7]熊海浪,于振艷,張宗申，等.影響瀕危藥用植物滇重樓愈傷組織發(fā)生的因素[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2012,23(6):1372-1374.

[8]熊海浪,易繼財(cái),張宗申.滇重樓種子萌發(fā)及組織培養(yǎng)研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,38(21):47-49.

[9]王艷芳,唐 玲,李榮英，等.影響滇重樓種子萌發(fā)及胚根生長因素的研究[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,35(2):28-31.

[10]Madhav K C,Sussana P,Pramod J.Ecological Study ofparispolyphyllaSM.[J].ECOS (Nepal),2010,17:87-93.

[11] Jaimsha Rani V K,Fijesh P V,Padikkala J.Micropropagation of ophiorrhiza eriantha wight.throught leaf explant cultures[J].Plant Tissue Cult & Biotech,2010,20(1):13-20.