黃先菊，周 歡，蔣 逸，任 煒，鄭 蜜，蔡光雄

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

雪上一枝蒿為毛茛科烏頭屬(Aconitum)植物短柄烏頭的干燥塊根，性溫，味苦、辛，有劇毒，能祛風(fēng)除濕、消炎鎮(zhèn)痛，用于風(fēng)濕骨痛、跌打腫痛和牙痛等癥療效顯著[1]. 雪上一枝蒿含有甲、乙、丙、丁、戊、己、庚素，烏頭堿，次烏頭堿，3-去氧烏頭堿，3-乙酰烏頭堿，雪烏堿，麗魯堿，準(zhǔn)葛爾烏頭堿，歐烏頭堿等[2].雪上一枝蒿甲、乙、丙、丁素均有鎮(zhèn)痛作用[3]，雪上一枝蒿速效止痛搽劑具有抗炎作用[4]，此外它還具有局麻、抗生育等作用[5].現(xiàn)代研究表明，烏頭屬植物可能具有一定的抗癌作用.烏頭屬植物多含aconitine型C19二萜生物堿[5]，主要有毒成分為烏頭堿，一般中毒劑量為 0.2 mg，致死量為2.0～4.0 mg ，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)先興奮后抑制，消化系統(tǒng)表現(xiàn)為流涎、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉，并直接作用于心臟，產(chǎn)生異常興奮，可致心率失常，甚至室顫而死亡[6].

本文采用一次灌胃給藥法觀察雪上一枝蒿不同提取部位(石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位)對(duì)小鼠急性毒性作用，并以MTT法觀察各個(gè)提取部位對(duì)Vero細(xì)胞的抑制作用.

1 材料和方法

1.1 材料

昆明小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體重18～22 g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(鄂)2008-0005].Vero細(xì)胞株(武漢病毒所王漢中老師饋贈(zèng)).雪上一枝蒿塊根(購自安徽亳州藥市)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO,Invitrogen,USA)，MTT(Biotech)，DMSO(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，胰酶(Amerisco公司)，其他試劑均為分析純.

全自動(dòng)酶標(biāo)儀(354型，上海Thermo公司)，CO2培養(yǎng)箱(MCO-15AC型，日本SANYO公司)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ型，上海AIRTECH公司)，臺(tái)式離心機(jī)(TDL80-2B型，上海安亭科技器材廠)，精密天平(AL204型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司).

1.2 方法

2.1.1 雪上一枝蒿不同提取物部位的制備

取雪上一枝蒿干藥材100 g粉碎，置于1000 mL圓底燒瓶中，分別加10倍、8倍、5倍量95％的乙醇，回流提取3次，每次分別為3,2,1 h，3層紗布過濾，合并提取液，兩層濾紙抽濾，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得23.6 g浸膏，用200 mL 0.2％的H2SO4超聲溶解，用石油醚多次萃取(至石油醚萃取液澄清，即石油醚部位充分萃取，下同)，得石油醚萃取液，剩余液用氨水調(diào)pH值為9～10，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分多次萃取，分別得到氯仿萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液；將各種萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、干燥后分別得石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位.

2.1.2 雪上一枝蒿活性部位對(duì)Vero細(xì)胞的毒性

Vero猴腎細(xì)胞培養(yǎng)于含10％小牛血清，青霉素(100 μg/mL) ，鏈霉素(100 μg/mL)的PRMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5％ CO2，相對(duì)濕度100％的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長情況，定期換液，對(duì)生長密度超過80％瓶底面積的細(xì)胞進(jìn)行消化傳代.用D-hank’s液沖洗2次，加入0.25％胰蛋白酶1 mL消化液，置37℃約3～4 min，倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間連接消失，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度，吸取上清液，加入完全培養(yǎng)液2 mL，反復(fù)吹打，將細(xì)胞吹打均勻.每次傳代的比例為1︰2，置于恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng).實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期.

[7] ，選取生長處于對(duì)數(shù)期的Vero猴腎細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度，轉(zhuǎn)移到96孔板中，12 h培養(yǎng)后加藥處理(乙酸乙酯提取部位、氯仿提取部位、石油醚提取部位、正丁醇提取部位)，培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/ mL MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h 后，去上清，加入150 μL DMSO溶解，于酶標(biāo)儀492 nm處檢測 OD 值，計(jì)算藥物的處理后Vero細(xì)胞存活率.

2.1.3 急性毒性試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，氯仿部位的LD50約為40 mg/kg，石油醚部位和正丁醇部位的LD50約為5000 mg/kg.取健康昆明小鼠140只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水，隨機(jī)分成14組，每組10只，雌雄各半.分組包括空白組、氯仿部位組、石油醚組和正丁醇組，劑量比值為0.6，其中氯仿部位組分為78.13,62.5,50,40,32,25.6,20.48 mg/kg 各7組， ；石油醚部位組分為3000,5000,8333 mg/kg各3組；正丁醇部位組分為3000,5000,8333 mg/kg各3組.氯仿組和正丁醇組以高壓滅菌水溶解藥物，石油醚部位以植物油溶解藥物，按10 mL/kg體積一次性灌胃給藥，空白組一次性給同等體積的高壓滅菌水，連續(xù)7 d觀察動(dòng)物的毒性表現(xiàn)和死亡數(shù).

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 雪上一枝蒿活性部位對(duì)Vero細(xì)胞的活性影響

雪上一枝蒿氯仿提取物對(duì)Vero細(xì)胞作用24 h后的毒性結(jié)果見圖1.如圖1所示，62.5,125,250,500 μg/mL的氯仿提取物均導(dǎo)致Vero細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01)，且具有劑量依賴性. 500 μg/mL氯仿提取物對(duì)Vero細(xì)胞的增值抑制率為63.9 ％.

ρ/(μg·mL-1)

雪上一枝蒿石油醚提取物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性結(jié)果見圖2.如圖2所示，7.8,15.6,31.2 μg/mL的石油醚提取物對(duì)Vero細(xì)胞存活率無明顯作用,62.5,125,250,500 μg/mL的石油醚提取物均導(dǎo)致Vero細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01)，藥物濃度為250 μg/mL和500 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率均小于50％.500 μg/mL石油醚提取物對(duì)Vero細(xì)胞的增值抑制率為69.7 ％.

ρ/(μg·mL-1)

雪上一枝蒿正丁醇提取物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性結(jié)果見圖3.如圖3所示，7.8,15.6,31.2,62.5,125,250,500 μg/mL的正丁醇提取物均導(dǎo)致Vero細(xì)胞存活率下降(P<0.05)，當(dāng)藥物濃度為500μg/mL時(shí)存活率最小，為67.1％,對(duì)Vero細(xì)胞的增值抑制率為32.9％.雪上一枝蒿乙酸乙酯提取物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性結(jié)果見圖4.

ρ/(μg·mL-1)

如圖4所示，藥物濃度為7.8,15.6,31.2,62.5,125,250 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞無明顯影響，500 μg/mL的乙酸乙酯提取物使Vero細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01)，為81.8％，對(duì)Vero細(xì)胞的增值抑制率為18.2 ％.

ρ/(μg·mL-1)

2.2 雪上一枝蒿不同部位的急性毒性

雪上一枝蒿不同活性成分給藥后4 h的中毒表觀特征(主要是嘔吐、腹式呼吸、怠動(dòng)和腹瀉)和死亡數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1.

表1 急性毒性實(shí)驗(yàn)中毒表征和死亡數(shù)統(tǒng)計(jì) (n=10，mean±SD)

由SPSS軟件處理以上數(shù)據(jù)得到雪上一枝蒿氯仿部位，石油醚部位，正丁醇部位3種不同活性成分的LD50分別為37.991 mg/kg(95％置信區(qū)間37.131～45.185 mg/kg)，6766.928 mg/kg(95％置信區(qū)間5440.313～8477.545 mg/kg)，5492.337 mg/kg(95％置信區(qū)間4344.933～7293.847 mg/kg).

3 討論

雪上一枝蒿治療量與中毒量十分接近，若用量不當(dāng)可以出現(xiàn)劇烈的毒性反應(yīng)，甚至死亡。其主要毒性成分為烏頭堿，中毒主要表現(xiàn)為出現(xiàn)心血管和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。本文結(jié)果表明，雪上一枝蒿不同提取部位對(duì)小鼠均有不同程度的毒性作用，氯仿部位提取物毒性為高毒，對(duì)昆明小鼠的經(jīng)口LD50為37.991 mg/kg，石油醚部位、正丁醇部位提取物微毒，對(duì)昆明小鼠的經(jīng)口LD50分別為6766.928,5492.337 mg/kg.

國內(nèi)有報(bào)道表明烏頭堿具有心臟毒性、肝毒性和腎毒性[8]，本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)乙醇總提物大劑量對(duì)豬腎PK-15細(xì)胞具有一定的毒性.本研究發(fā)現(xiàn)，500 μg/mL的氯仿提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)Vero細(xì)胞的增值抑制率分別為63.9％,69.7％,32.9％和18.2％，表明4個(gè)提取部位對(duì)Vero細(xì)胞均有一定毒性，其毒性機(jī)制有待進(jìn)一步研究.

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