張立新，馮才偉，賈芳芳 ，劉玉梅，楊 爍

（1.北京市優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)銷服務(wù)站，北京 100101；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206）

甲羥孕酮又稱甲孕酮，是一種長(zhǎng)期避孕藥，也可用于一些對(duì)激素敏感腫瘤的姑息治療；魚類會(huì)因?yàn)樗形⒘康募琢u孕酮而改變性別。人食用含有甲羥孕酮的動(dòng)物源性食品后，會(huì)擾亂人體內(nèi)分泌、生長(zhǎng)發(fā)育、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等方面的正常功能，還可能致癌、致畸，因此建立檢測(cè)動(dòng)物源性食品中甲羥孕酮?dú)埩舻姆椒ê苡斜匾?。目前，檢測(cè)該類藥物的方法主要是儀器法，但其資金、人員等成本投入較高，不宜推廣。本試驗(yàn)運(yùn)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，測(cè)定了雞肉和魚肉中甲羥孕酮的殘留量，旨在尋找成本更低的替代檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 甲羥孕酮ELISA檢測(cè)試劑盒（包含96孔酶標(biāo)板，甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物，底物液、終止液、洗滌液、復(fù)溶液），購(gòu)自北京某生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、乙腈等購(gòu)自北京某試劑公司；雞肉、魚肉樣品購(gòu)自超市；酶標(biāo)儀購(gòu)自上海某分析儀器有限公司，渦旋儀、均質(zhì)器購(gòu)自湖南某科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理。用均質(zhì)器均質(zhì)肉組織樣本；稱取（3.0±0.05）g均質(zhì)物至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入6mL乙腈-0.1mol/L氫氧化鈉溶液，渦動(dòng)2min，4 500 r/min以上，室溫離心5min；取出1mL上清液至15mL干凈的玻璃試管中，于50～60℃氮?dú)饬飨麓蹈?；加?mL復(fù)溶液，用渦旋儀渦動(dòng)1 min，然后取100 μL加入到 900 μL復(fù)溶液中，混勻；最后取50 μL 用于檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)步驟。取出所需數(shù)量的微孔板，將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做兩孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置；加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50 μL到對(duì)應(yīng)的微孔中，然后加入酶結(jié)合物（50 μL/孔），輕輕振蕩、混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min；小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌液（250μL/孔），充分洗滌4～5次，每次間隔10s，倒出板孔內(nèi)的洗滌液，用吸水紙拍干；加入底物液A液（50μL/孔），再加入底物液 B 液（50 μL/孔），輕輕振蕩、混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15 min；加入終止液（50μL/孔），輕輕振蕩、混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔的吸光度值（OD值）。

1.2.3 百分吸光率的計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值的平均值,再乘以100%，即

式中：B——標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液的平均吸光度值；

B0——0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中甲羥孕酮的實(shí)際濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)1.2.2步驟，分別測(cè)定濃度為0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 μg/L 甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。詳見表1、圖1和圖2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的ELISA測(cè)定

圖1 甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

試驗(yàn)表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量濃度范圍在0.03～0.48μg/L，IC50（50%抑制濃度）為83.0μg/L；線性方程y=-2.1773x+1.5218，R2=0.9938。

2.2 檢測(cè)限 對(duì)20份空白雞肉和20份空白魚肉樣本進(jìn)行檢測(cè)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)于各百分吸光率的濃度。以20份樣本甲羥孕酮濃度的平均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示檢測(cè)限（MDL），即 MDL=x+3s。結(jié)果顯示，該酶聯(lián)免疫法對(duì)雞肉和魚肉樣本的檢測(cè)限均為1μg/kg。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 酶聯(lián)免疫法的準(zhǔn)確度用回收率表示，精密度用變異系數(shù)表示。在空白雞肉和魚肉樣本中添加濃度為1、2、4μg/kg的甲羥孕酮，用3個(gè)批次的ELISA試劑盒進(jìn)行回收試驗(yàn)，每個(gè)添加量做4個(gè)平行，結(jié)果見表2、表3。

表2 雞肉樣本精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)

表3 魚肉樣本精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)

從表2、表3可見，對(duì)雞肉樣品進(jìn)行添加，甲羥孕酮的平均回收率在68.3%～94.6%之間；對(duì)魚肉樣品進(jìn)行添加，其平均回收率在65.5%～93.2%之間；兩個(gè)樣本的批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10%。

2.4 交叉反應(yīng)率試驗(yàn) 根據(jù)交叉反應(yīng)率公式，計(jì)算得到甲羥孕酮試劑盒與甲地孕酮、孕酮、己烯雌酚、炔諾酮的交叉反應(yīng)率均小于1%，說(shuō)明該酶聯(lián)免疫試劑盒的特異性較高。結(jié)果見表4。

表4 交叉反應(yīng)率試驗(yàn)

2.5 儀器法比對(duì)試驗(yàn) 取50份雞肉和魚肉樣本，用“SN/T 1625-2005進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中甲羥孕酮和醋酸甲羥孕酮?dú)埩袅康臋z測(cè)方法：氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定方法”進(jìn)行儀器對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果顯示該儀器法的檢測(cè)限為1μg/kg。表明本次試驗(yàn)所用試劑盒的檢測(cè)結(jié)果和儀器法的檢測(cè)結(jié)果是一致的。詳見表5、表6。

表5 雞肉樣本的酶聯(lián)免疫法和儀器法對(duì)比試驗(yàn) μg/kg

表6 魚肉樣本的酶聯(lián)免疫法和儀器法對(duì)比試驗(yàn) μg/kg

3 結(jié)論

酶聯(lián)免疫法對(duì)雞肉和魚肉樣本的檢測(cè)限均為1 μg/kg。當(dāng)甲羥孕酮的添加濃度為 1、2、4μg/kg時(shí)，其平均回收率范圍在65.5%～94.6%；交叉反應(yīng)率試驗(yàn)表明該試劑盒的特異性良好；酶聯(lián)免疫法與儀器法的驗(yàn)證結(jié)果一致。由于某些不可避免的人為誤差，不同批次的ELISA試劑盒在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致，而本試驗(yàn)所用甲羥孕酮檢測(cè)試劑盒的批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，重現(xiàn)性較好。該酶聯(lián)免疫法的操作時(shí)間短，靈敏度較高，檢測(cè)限低，不需要昂貴的儀器設(shè)備，操作方法較簡(jiǎn)單，因此適合現(xiàn)場(chǎng)大批量檢測(cè)樣本的快速檢測(cè)。

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