李王安 荊國(guó)杰 姚曉騰 林 才

廣東惠州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科 惠州 516003

腦血管痙攣（CVS）是蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）患者致死和致殘的主要原因之一，常于SAH 后3～5d出現(xiàn)，發(fā)生率達(dá)45%［1］。過(guò)去數(shù)十年，不斷有學(xué)者從細(xì)胞、分子水平對(duì)腦血管痙攣的發(fā)病機(jī)制作出闡述［2-4］，但至今尚未完全闡明。增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）作為各種細(xì)胞增殖的指標(biāo)可敏感反映細(xì)胞增殖活性。自Harrison 等［5］發(fā)現(xiàn)SAH 患者CSF中與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖有關(guān)的多種血管有絲分裂原呈異常表達(dá)以來(lái)，血管細(xì)胞增殖與腦血管痙攣的關(guān)系逐漸引人關(guān)注［6-7］。我們利用兔SAH 模型，采用免疫組化方法觀察了SAH 后腦基底動(dòng)脈壁PCNA 的表達(dá)，以探討血管細(xì)胞增殖在腦血管痙攣發(fā)生中的作用和意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用健康新西蘭大白兔（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）30只，體質(zhì)量2.5～3.0kg，雌雄不限。6只用于預(yù)實(shí)驗(yàn)。其余隨機(jī)分為SAH 組、假手術(shù)組和正常組3組，各8只。

1.2 動(dòng)物模型的建立 兔用氯胺酮（30mg／kg）肌內(nèi)注射麻醉后以俯臥頭低位固定于動(dòng)物立體定位儀，行枕部穿刺緩慢放出清亮腦脊液2mL，同時(shí)抽取2mL未抗凝自體新鮮動(dòng)脈血緩慢注入枕大池。保持原體位30min，48h后重復(fù)上述過(guò)程［1］。假手術(shù)組則以生理鹽水代替自體動(dòng)脈血注入枕大池，正常組不予任何處理。

1.3 標(biāo)本制作及病理觀察 各組動(dòng)物于SAH 后第5天采用心臟灌注法處死并取材：氯胺酮麻醉后開(kāi)胸，充分暴露心臟及主動(dòng)脈，將套管針從左心室插入升主動(dòng)脈，固定套管開(kāi)始灌注（灌注壓120cmH2O），同時(shí)剪開(kāi)右心耳放血。先灌注0.9% NS，待右心流出液接近無(wú)色時(shí)，改為灌注4%多聚甲醛固定液（pH 7.4）。灌注完后即開(kāi)顱取基底動(dòng)脈中段以4%多聚甲醛固定備用。常規(guī)脫水，石蠟包埋，修蠟切片。標(biāo)本切片部分行HE 染色，光鏡（NIKON E1000 生物顯微鏡）觀察并攝影，采用德國(guó)Sigma Scan Pro 4.0病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量血管橫截面積。免疫組化檢測(cè)采用PCNA 抗體（武漢博士德生物工程有限公司提供）行SABC 法染色（操作流程按試劑說(shuō)明書(shū)），定位于血管壁及鄰近腦膜細(xì)胞核內(nèi)，陽(yáng)性細(xì)胞核染色為棕褐、棕黃色。以結(jié)腸癌細(xì)胞增殖核抗原作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，每個(gè)標(biāo)本取2張切片，每張切片隨機(jī)取3個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)全部細(xì)胞，以陽(yáng)性細(xì)胞為分子計(jì)算PCNA 表達(dá)指數(shù)百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 13.0 軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 SAH 后第5天，肉眼見(jiàn)假手術(shù)組和正常組兔后顱窩各腦池內(nèi)充滿(mǎn)清亮腦脊液，無(wú)血凝塊殘留；光鏡下基底動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)正常，管壁無(wú)增厚，管腔呈圓形或橢圓形，2組管腔橫截面積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SAH 組各兔后顱窩各腦池內(nèi)殘留大小不等的暗紅色血凝塊，以基底池較重，周?chē)刖W(wǎng)膜部分粘連；光鏡下基底動(dòng)脈發(fā)生明顯的病理變化（圖1）：管壁增厚、管腔狹小，平均管腔橫截面積分別為假手術(shù)組的46.4%、正常組的44.8%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；內(nèi)皮細(xì)胞變形、部分胞漿可見(jiàn)空泡；內(nèi)彈力膜明顯迂曲皺折、厚薄不均；平滑肌細(xì)胞排列紊亂、部分胞核濃縮深染、核周間隙增寬；外膜細(xì)胞增多，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞。

2.2 PCNA 染色結(jié)果 術(shù)后第5天假手術(shù)組及正常組基底動(dòng)脈管壁PCNA 表達(dá)不明顯，2組間PCNA 陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而在SAH 組血管外膜及鄰近腦膜中有強(qiáng)表達(dá)（見(jiàn)圖2），陽(yáng)性細(xì)胞核染色多為棕褐色，與前2組相比PCNA 陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

圖1 兔SAH 后第5天基底動(dòng)脈HE 染色結(jié)果A：SAH 組（×100）；B：正常組（×100）；C：A 圖局部放大（×400）；D：B圖局部放大（×400）

圖2 兔SAH 后第5 天基底動(dòng)脈免疫組化染色結(jié)果A：SAH 組基底動(dòng)脈管壁PCNA 染色（核呈棕褐色者為陽(yáng)性細(xì)胞）（×100）；B：假手術(shù)組基底動(dòng)脈管壁PCNA 染色（×100）；C：A 圖局部放大（×400）

表1 術(shù)后第5天基底動(dòng)脈管壁PCNA 染色結(jié)果 （±s）

表1 術(shù)后第5天基底動(dòng)脈管壁PCNA 染色結(jié)果 （±s）

注：P 值為各組與正常組比較

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3 討論

SAH 后有多種致痙物質(zhì)出現(xiàn)，尤其是血液降解產(chǎn)物，如氧合血紅蛋白（OxyHb）、膽紅素和高鐵血紅蛋白等，各種刺激因子作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，導(dǎo)致早期的腦血管急性痙攣［8］。若急性痙攣未被逆轉(zhuǎn)，痙攣的腦血管發(fā)生結(jié)構(gòu)改變［9］，如細(xì)胞壞死、膠原沉積、纖維變形、平滑肌細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞增殖，這些改變導(dǎo)致病變動(dòng)脈壁增厚、血管順應(yīng)性降低。本研究利用光鏡觀察SAH 組基底動(dòng)脈常規(guī)HE染色后血管壁的改變也證實(shí)了這一點(diǎn)，Borel等［10］在2003年首次報(bào)道在小鼠枕大池注血后72h基底動(dòng)脈及周?chē)X膜組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)較對(duì)照組顯著增多，且痙攣血管發(fā)生的增殖與臨床及影像學(xué)觀察到的腦血管痙攣有密切關(guān)系。PCNA 位于細(xì)胞核內(nèi)且僅在S期出現(xiàn)，S期結(jié)束時(shí)消失，所以又稱(chēng)細(xì)胞周期蛋白，是S期的特異性標(biāo)記。PCNA 作為各種細(xì)胞增殖的指標(biāo)可敏感反映細(xì)胞增殖活性，其表達(dá)量可客觀反映細(xì)胞增殖的數(shù)量及分布。一般來(lái)說(shuō)，成年個(gè)體血管平滑肌細(xì)胞在生理情況下增殖率很低，無(wú)明顯增殖表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組和正常組基底動(dòng)脈管壁PCNA 表達(dá)很弱，而SAH 組兔基底動(dòng)脈管壁外膜及鄰近腦膜上PCNA 有強(qiáng)表達(dá)（與對(duì)照的2 組相比PCNA 陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），但中膜及內(nèi)膜較少，這與Borel等［9］觀察結(jié)果相似。我們認(rèn)為這主要是因?yàn)橥肧AH 模型血液是由枕大池注入而非由血管壁破裂后引起，聚積在血管周的血凝塊及其產(chǎn)物主要刺激血管外膜及周?chē)M織，繼而觸發(fā)大量促進(jìn)血管細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子釋放，最終導(dǎo)致血管外膜纖維母細(xì)胞、血管周?chē)X膜組織及部分中膜平滑肌細(xì)胞發(fā)生增殖，細(xì)胞核內(nèi)PCNA 表達(dá)增強(qiáng)。

然而，血管細(xì)胞增殖與腦血管痙攣的臨床或影像學(xué)征象之間的關(guān)系至今還無(wú)法定論?？赡苎鼙诟鲗蛹?xì)胞及鄰近組織發(fā)生增殖后血管壁逐漸增厚，反過(guò)來(lái)又導(dǎo)致血管不可逆的僵硬、彈性和柔韌性下降、管腔狹窄、血供減少，最終發(fā)生遲發(fā)性腦血管痙攣、腦缺血而引起神經(jīng)功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，SAH 后PCNA 的表達(dá)強(qiáng)度與腦血管痙攣的發(fā)生及基底動(dòng)脈管壁管腔的病理改變有密切關(guān)系，提示血管細(xì)胞增殖及其導(dǎo)致的血管壁增厚在腦血管痙攣發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要意義。

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