孫陽，史默怡，石學(xué)魁，王亞賢

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是生物體內(nèi)一類活性含氧化合物的總稱，產(chǎn)生于機(jī)體代謝的過程中，對細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、衰老、癌變以及基因表達(dá)都有影響，故而近年來對其研究逐漸深入。ROS對機(jī)體作用有著兩面性。在氧化應(yīng)激的狀態(tài)下，ROS產(chǎn)生過多或清除過少，可致使機(jī)體ROS過多，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致組織損傷，引起很多疾病。最近的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中ROS升高或氧化還原平衡改變，可由促凋亡信號引起，這可作為凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。當(dāng)?shù)蛲鰡雍螅琑OS可進(jìn)一步促進(jìn)凋亡的進(jìn)程。ROS對細(xì)胞周期的調(diào)控促使ROS升高可以作為抗腫瘤的機(jī)制之一。另外，ROS對細(xì)胞周期的調(diào)控同樣起作用，如信號的級聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞骨架的重組等都與ROS有關(guān)［1］。因此，藥物如果促使ROS升高可以作為抗腫瘤的機(jī)制之一。紅花具有活血化瘀的功效，同時具有調(diào)節(jié)人體免疫力和抗腫瘤的作用［2］。但是對其抗腫瘤的機(jī)理研究并不深入。本實(shí)驗(yàn)研究紅花多糖對人肝癌SMMC－7721 細(xì)胞增殖的影響，通過流式細(xì)胞儀對ROS進(jìn)行檢測分析，來探討藥物對腫瘤細(xì)胞的影響。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)藥品 紅花購于哈爾濱益壽堂藥店，應(yīng)用水提純沉淀法進(jìn)行紅花多糖的提取及純化［3］。

1．2 主要儀器與試劑 流式細(xì)胞儀(BDAira);CO2培養(yǎng)箱(TC2323);倒置顯微鏡(XDS－1B);Multiskan Mk3 酶標(biāo)儀;活性氧檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號:S0033);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，貨號:M2128);二甲基亞砜(DMSO，貨號:D2650)。

1．3 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌SMMC－7721 細(xì)胞(武漢博士德公司，編號:CX0296)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)密度為1×105個/mL，接種到5mL含有10%熱滅活的新生牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況，實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1．4 MTT比色實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期細(xì)胞1×104個/mL接種于96 孔板，每孔體積200μL，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁，呈單層生長。24h細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，加入含10%新生牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的紅花多糖，每個劑量設(shè)6個復(fù)孔。加入藥物后分別培養(yǎng)24h和48h，每孔吸棄上清液20μL，加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃ 、5%CO2飽和濕度條件下繼續(xù)孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，避光振蕩10min，使沉淀結(jié)晶充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm波長檢測各孔A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按公式計算細(xì)胞的生長抑制率(inhibition rate，IR%)。IR=(1－A實(shí)驗(yàn)組平均值/A對照組平均值)×100%。

1．5 細(xì)胞內(nèi) ROS含量的檢測 利用熒光探針DCFH－DA對活性氧進(jìn)行檢測。DCFH－DA本身沒有熒光，可以自由通過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。DCFH不能透過細(xì)胞膜，從而能很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。采用流式細(xì)胞儀可以檢測出熒光強(qiáng)度，間接反應(yīng)出細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。通過MTT實(shí)驗(yàn)，紅花多糖分為高、中、低三個劑量組，設(shè)定藥物作用時間48h。48h后，采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。用PBS液洗滌細(xì)胞2次，加入終濃度10μmol/L的DCFH－DA，充分作用，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下孵育20min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH－DA。用500μL PBS液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析熒光強(qiáng)度，使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長。

2 結(jié)果

2．1 SPS對肝癌細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察SPS作用于SMMC－7721 細(xì)胞后其形態(tài)的改變。0mg/mLSPS組細(xì)胞貼壁生長良好，密集生長，排列均勻，折光性好，大小較一致，形狀呈三角形或多邊形，增殖旺盛，胞漿豐滿。隨著紅花多糖濃度的增加，貼壁細(xì)胞密度降低，細(xì)胞間連接消失，細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯減少;部分細(xì)胞體積增大、胞膜泡狀、細(xì)胞崩解;部分細(xì)胞變圓，體積縮小，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞脫落懸浮于培養(yǎng)基中的數(shù)量逐漸增加，細(xì)胞周圍碎片增多。

2．2 SPS對肝癌細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，不同劑量組SPS分別作用于肝癌細(xì)胞24h和48h后，48h優(yōu)于24h，SPS對細(xì)胞的抑制作用明顯。各組A值與0mg/mLSPS組A值比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)，隨著SPS劑量的增加，對SMMC－7721 細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)。但當(dāng)SPS劑量為1．28mg/mL時，抑制率卻有所下降。說明藥物最佳劑量應(yīng)不超過此劑量。

表1 SPS對肝癌細(xì)胞增殖的影響(±s)

表1 SPS對肝癌細(xì)胞增殖的影響(±s)

注:與0mg/ml組比較，＊＊P ＜0．01。

0 0．815 ±0．078－0．981 ±0．048 21．510．02 0．801 ±0．059 1．7 0．770 ±0．031＊＊－0．04 0．712 ±0．027＊＊ 12．6 0．689 ±0．027＊＊ 29．770．08 0．689 ±0．029＊＊ 15．5 0．648 ±0．038＊＊ 33．940．16 0．656 ±0．048＊＊ 19．5 0．593 ±0．029＊＊ 39．550．32 0．578 ±0．032＊＊ 29．1 0．528 ±0．032＊＊ 46．180．64 0．492 ±0．026＊＊ 39．6 0．489 ±0．019＊＊ 50．151．28 0．559 ±0．030＊＊ 31．4 0．517 ±0．023＊＊47．30

2．3 SPS對細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測 根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在 ROS 測定時，選取 0．16mg/mL、0．32mg/mL 和0．64mg/mLSPS(即為高、中、低)三個劑量組分別作用SMMC－7721 細(xì)胞48h進(jìn)行檢測。通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測ROS后，結(jié)果如圖1 所示，各用藥組ROS較空白組有所增加，并隨劑量的增加成正相關(guān)。說明紅花多糖對ROS的增加有促進(jìn)作用，可能通過此途徑來抑制腫瘤細(xì)胞增殖。見圖1。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的腫瘤細(xì)胞的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性明顯低于正常細(xì)胞，而這兩種酶是細(xì)胞清除ROS的主要酶，所以腫瘤細(xì)胞對ROS很敏感。化學(xué)藥物去甲氧柔紅霉素誘導(dǎo)白血病和神經(jīng)母細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)的ROS密切相關(guān)。鄒少娜［4］等發(fā)現(xiàn)，沒食子兒茶素沒食子酸誘導(dǎo)MGC803 細(xì)胞凋亡并發(fā)現(xiàn)ROS含量增加。目前，發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡存在三條途徑:線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑。這三條途徑經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)皆與ROS密切相關(guān)。另外，ROS可以調(diào)控細(xì)胞周期，高氧可以致使細(xì)胞在G1、S和G2 期增殖阻滯，細(xì)胞增殖受到抑制［5］。

圖1 SPS作用48h后ROS的影響

因此，提高腫瘤細(xì)胞中的ROS的含量，可以增加藥物對細(xì)胞的作用，對腫瘤預(yù)防和治療都有著很重要的醫(yī)學(xué)價值。

本實(shí)驗(yàn)研究SPS對人肝癌SMMC－7721 細(xì)胞的影響。結(jié)果，SPS對細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并可提高ROS的含量。這可能與ROS增多，DNA受到損傷，導(dǎo)致p53 活性被誘導(dǎo)，繼而細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子表達(dá)增加，細(xì)胞生長停止于某一階段，并產(chǎn)生凋亡或死亡［6］。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們會就此問題進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和探討。

［1］ 成軍．現(xiàn)代細(xì)胞周期分子生物學(xué)［M］．北京:科學(xué)出版社，2010:433．

［2］ 石學(xué)魁，阮殿清，王亞賢，等．紅花多糖的提取與含量測定［J］．中國中藥雜志，2010，35(2):215－218．

［3］ 張曉麗，李玉婷，王亞賢，等．紅花多糖的提取與含量測定［J］．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(7):19－21．

［4］ 鄒少娜，林敏，伍石華，等．活性氧在EGCG誘導(dǎo)胃癌MGC803 細(xì)胞凋亡中的作用［J］．中國癌癥雜志，2010，20(5):344－347．

［5］ 余祖撤，毛秉智，從玉文．活性氧與細(xì)胞周期調(diào)控［M］．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2007，6(31):576－578．

［6］ Moiseeva O，Mallette FA，Mukhopadyay UK，et al．DNA damage signaling and p53－dependent senescence after prolonged beta－interferon stimulation［J］．Mol Biol Cell，2006，17(4):1583－1592．