王嘉盛，劉淑清，郭春梅，孫明忠

(1. 大連醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室，遼寧 大連 116044；2. 大連醫(yī)科大學 生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044)

基礎(chǔ)醫(yī)學

ANXA11表達穩(wěn)定下調(diào)的肝癌Hca-P細胞株的建立

王嘉盛1，劉淑清1，郭春梅2，孫明忠2

(1. 大連醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室，遼寧 大連 116044；2. 大連醫(yī)科大學 生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044)

目的構(gòu)建針對膜聯(lián)蛋白A11(Annexin A11，ANXA11) 的shRNA(small hairpin RNA)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠低淋巴道轉(zhuǎn)移力肝癌Hca-P細胞，篩選ANXA11穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細胞株，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。方法合成2條ANXA11的shRNA序列(shRNA-1和-2),與真核表達載體pGPU6/GFP/Neo連接，構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11表達載體并轉(zhuǎn)染Hca-P細胞，通過G418篩選及有限稀釋法獲得單克隆細胞株，Western blot檢測Hca-P細胞ANXA11蛋白表達，并與空載體轉(zhuǎn)染及對照組比較。結(jié)果成功構(gòu)建了pGPU6/GFP/Neo-shRNA- ANXA11重組表達質(zhì)粒，并獲得pGPU6/GFP/Neo- shRNA- ANXA11-Hca-P單克隆細胞株；shRNA-1重組質(zhì)粒的抑制效果在mRNA和蛋白水平對ANXA11抑制率分別為80.2%和77.7%，P<0.01。結(jié)論通過RNA干擾和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)成功建立了ANXA11表達穩(wěn)定下調(diào)的Hca-P細胞株，得到了其單克隆細胞株，為進一步研究ANXA11在惡性腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用及機制打下了基礎(chǔ)。

ANXA11；淋巴道轉(zhuǎn)移；Hca-P；RNA干擾

肝癌致死率位居癌癥死亡率第2位，肝外腫瘤轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者預(yù)后和生存重要因素，淋巴道轉(zhuǎn)移是肝癌轉(zhuǎn)移的一個重要途徑[1]，探究肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移機制對肝癌防治有重要意義。膜聯(lián)蛋白A11(Annexin A11, ANXA11)為膜聯(lián)蛋白家族成員之一，是Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，其廣泛表達于各種組織細胞中，參與細胞Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞分化、分裂及凋亡、溶血栓等生物學活動[2-5]。ANXA11表達失調(diào)在腫瘤惡變、耐藥性及轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要的作用[6-8], 但ANXA11與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移之間關(guān)系未見報道。

本實驗室前期對來源于同一親本，遺傳背景基本相同但淋巴道轉(zhuǎn)移力顯著不同的小鼠肝癌腹水型細胞株Hca-F和Hca-P[9]的研究發(fā)現(xiàn)：ANXA11在低淋巴道轉(zhuǎn)移細胞株Hca-P中的表達顯著高于高轉(zhuǎn)移力株Hca-F(未發(fā)表)，提示其是潛在參與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)蛋白。本研究構(gòu)建了針對ANXA11的特異性真核表達載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11，并體外轉(zhuǎn)染至Hca-P細胞，獲得了ANXA11表達穩(wěn)定下調(diào)的Hca-P，為研究ANXA11在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1. 1 材料和試劑

Hca-P(P cell)、pGPU6/ GFP/Neo真核表達載體質(zhì)粒由本實驗室保存；凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-RAD公司，美國)；熒光倒置顯微鏡(Olympus，日本)；Sofast轉(zhuǎn)染試劑(廈門太陽馬生物工程有限公司)；一抗Anti-AnxA11、Anti-β-actin、二抗Goat anti-rabbit IgG(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.2 構(gòu)建shRNA-ANXA11-pGPU6/GFP/Neo表達載體

1.2.1 shRNA序列設(shè)計：依據(jù)AXNA11的mRNA序列(NM_013469.2)，遵循Kumiko等[10-11]的shRNA干擾序列設(shè)計原則，采用Ambion和Whitehead設(shè)計軟件設(shè)計2條干擾序列shRNA-1、shRNA-2和無關(guān)對照序列 (shRNA-NC) (表1)。

表1 shRNA序列

1.2.2 Annexin A11基因shRNA表達載體構(gòu)建：將上述shRNA序列分別用TE buffer溶解，分別取相應(yīng)的正義鏈和反義鏈oligo溶液，加水混合，在PCR儀上進行退火處理。退火處理后所得的shRNA模板溶液稀釋至終濃度200 nmol/L，pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒(5117 bp)通過雙酶切方法得到線性化產(chǎn)物，1%瓊脂糖電泳鑒定。將上述退火產(chǎn)物用T4連接酶連接至線性化質(zhì)粒中，再將連接產(chǎn)物(shRNA- ANXA11-1、shRNA-ANXA11-2、shRNA-ANXA11-NC)分別轉(zhuǎn)入DH5α，37 ℃過夜培養(yǎng)，然后挑單克隆37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，堿裂解法抽提質(zhì)粒。

1.2.3 Annexin A11基因shRNA表達載體鑒定：將上述抽提質(zhì)粒進行單酶切鑒定，1%瓊脂糖電泳鑒定，并測序確認。

1.3 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hca-P細胞

取對數(shù)生長期Hca-P，1000 rpm，離心5 min，然后用RPMI1640重懸細胞并計數(shù)，按106個/50 μL量接種于615小鼠腹腔；培養(yǎng)5～7 d后抽取腹水Hca-P細胞，PBS清洗3次，用15% RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，細胞計數(shù)，接種于24孔板。每個實驗組設(shè)3個復(fù)孔，105個/孔，細胞懸液500 μL/孔。實驗分4組：Hca-P細胞及分別轉(zhuǎn)染shRNA-1、shRNA-2、shRNA-NC的Hca-P細胞。用Sofast轉(zhuǎn)染試劑盒進行重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，48 h后，采用熒光倒置顯微鏡計數(shù)表達GFP細胞數(shù)，計算出各組細胞轉(zhuǎn)染效率。

1.4 單克隆細胞篩選

轉(zhuǎn)染48 h后，向轉(zhuǎn)染細胞中加入含400 μg/mL G418完全培養(yǎng)基進行篩選。7 d左右大部分細胞死亡，14 d后存活并增殖細胞為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功細胞；培養(yǎng)21 d后，將轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)移到細胞瓶中培養(yǎng)，細胞計數(shù)，調(diào)整每個干擾組細胞數(shù)為105個，采用有限稀釋法稀釋細胞，至得到100個/mL細胞懸液；在96孔板孔中加入10 μL稀釋的細胞懸液并補加完全培養(yǎng)基至150 μL，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；然后采用倒置顯微鏡對篩到的轉(zhuǎn)染成功的單克隆Hca-P及正常Hca-P細胞進行細胞形態(tài)學觀察。

1.5 RT-PCR鑒定ANXA11 mRNA表達

使用Trizol試劑提取篩到的單克隆細胞總RNA 并進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。內(nèi)參GAPDH引物：F primer 5′-GGT GAA GGT CGG TGT GAA CG-3′, R primer 5′-CTC GCT CCT GGA AGA TGG TG-3′; ANXA11：F primer 5′-TGG CAG TTT TCA ACG AGT ATC AGA-3′, R primer 5′-ATA TCG TGG TAC AGT GAC TTG-3′, 通過PCR擴增目的基因。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，并計算目的條帶與內(nèi)參的比值進行定量。

1.6 Western blot鑒定ANXA11蛋白表達

收集每個實驗組細胞，1000 rpm，離心5 min，棄上清，使用凱基總蛋白提取試劑盒提取細胞沉淀總蛋白，采用BCA方法進行蛋白濃度測定。然后進行10% SDS-PAGE，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；37 ℃封閉，一抗Anti-β-actin和Anti-AnxA11 4 ℃孵育過夜；洗膜，加二抗Goat anti-rabbit IgG，在37 ℃孵育1.5 h。采用ECL發(fā)光方法檢測蛋白條帶，灰度分析目的條帶對內(nèi)參比值，比較各轉(zhuǎn)染組間ANXA11的表達差異。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 shRNA表達載體鑒定

重組質(zhì)?？杀籅amH Ⅰ酶切，而不被Pst Ⅰ酶切，得到的shRNA-ANXA11-1、shRNA-ANXA11-2、shRNA-ANXA11-NC質(zhì)粒BamH Ⅰ酶切電泳條帶在4254～6223 bp之間(圖1), 表明構(gòu)建初步成功。測序得到的shRNA序列與預(yù)期一致，表明shRNA表達載體構(gòu)建成功。

圖1酶切鑒定重組真核表達載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11

Fig 1 Identification of recombinant pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11 plasmid by enzyme digestion

M: lamda/Ecol130I marker; 1: BamH I/shRNA-ANXA11-1; 2: BamH I/shRNA-ANXA11-2; 3: BamH I/shRNA-ANXA11-NC；4: Pst I/shRNA-ANXA11-1; 5: Pst I/shRNA-ANXA11-2; 6: Pst I/shRNA-ANXA11-NC

2.2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率及細胞形態(tài)變化

shRNA-ANXA11-1、shRNA-ANXA11-2和shRNA-ANXA11-NC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率約為5%、10%和13%。熒光顯微鏡下觀察單克隆pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11-1 (P-1)、pGPU6/GFP/ Neo-shRNA -ANXA11-2 (P-2)和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11-NC (P-NC)有明顯的GFP綠色熒光，表明shRNA-ANXA11重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。與Hca-P細胞相比，P-1和P-2的體積變大、細胞膜凹凸不平、聚團生長增強、細胞內(nèi)容物增多，P-NC細胞與Hca-P細胞則無以上形態(tài)的明顯變化(圖2)。

2.3 RT-PCR及Western blot鑒定

RT-PCR檢測結(jié)果顯示shRNA-1對ANXA11干擾率為80.2%；但shRNA-2并沒有對ANXA11進行有效的干擾且出現(xiàn)輕微的mRNA上調(diào)現(xiàn)象；shRNA-NC與Hca-P比較差異無顯著性意義(P>0.05) (圖3A、B)。Western blot結(jié)果表明shRNA-1和shRNA-2在蛋白水平對ANXA11的下調(diào)為77.7%和32.8%，且shRNA-1和shRNA-2對ANXA11的下調(diào)差異有顯著性意義 (P<0.01)；shRNA-NC-Hca-P與Hca-P差異無顯著性意義(P>0.05)(圖4A、B)。shRNA-1能顯著抑制ANXA11蛋白表達，與mRNA水平的干擾一致。

圖2 各細胞株在倒置顯微鏡觀察下的形態(tài)(×200)

圖3 ANXA11 mRNA在各細胞株中相對表達情況(A)各細胞株中ANXA11 mRNA相對變化; (B)RT-PCR結(jié)果*：與P cell比較P<0.01

圖4 ANXA11蛋白在各細胞株中相對表達情況(A)各細胞株中ANXA11 蛋白相對水平; (B) Western blot結(jié)果 *：與P cell比較P<0.01

3 討 論

ANXA11為膜聯(lián)蛋白超家族成員之一，與眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后以及易感性等具有緊密聯(lián)系[2-5]。ANXA11與腫瘤的發(fā)生、惡性發(fā)展以及耐藥性相關(guān)，抑制ANXA11的表達能增強卵巢癌細胞對化療藥物順鉑的耐受性；ANXA11高表達與乳腺癌和直腸癌的惡性發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等正相關(guān)； ANXA11表達的顯著下調(diào)能影響人表皮鱗癌細胞A431胞質(zhì)分裂中間體的形成，從而導(dǎo)致細胞凋亡。因此ANXA11與腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥性及患者預(yù)后相關(guān)，可作為潛在靶標分子殺傷腫瘤細胞[3,6-8]。

本組前期發(fā)現(xiàn)ANXA11在親本來源相同的鼠肝癌低淋巴道轉(zhuǎn)移力Hca-P細胞株中的蛋白表達量是高淋巴道轉(zhuǎn)移力Hca-F的2.2倍(P<0.05)，揭示ANXA11可能與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)。RNAi是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA特異沉默基因轉(zhuǎn)錄，可高特異性、高效性地研究某基因?qū)δ[瘤細胞的影響以及腫瘤基因治療[12]。本研究為探索ANXA11對Hca-P細胞在淋巴道轉(zhuǎn)移中所起作用，采用RNAi技術(shù)，設(shè)計了ANXA11的特異性shRNA序列，構(gòu)建了其shRNA表達載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Hca-P細胞，并篩選得到ANXA11顯著穩(wěn)定下調(diào)的Hca-P單克隆細胞。為深入研究ANXA11表達失調(diào)對小鼠肝癌低淋巴道轉(zhuǎn)移力Hca-P細胞的影響及腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移機制研究奠定前期基礎(chǔ)。

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ConstructionofmousehepatomaHca-PwithstableknockdownofANXA11gene

WANGJia-sheng1,LIUShu-qing1,GUOChun-mei2,SUNMing-zhong2

(1.DepartmentofBiochemistry,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China; 2.DepartmentofBiotechnology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

ObjectiveTo design small hairpin RNA (shRNA) targeting Annexin A11 (ANXA11), to transfect mouse hepatoma Hca-P with Annexin A11 (ANXA11), to obtain the Hca-P cell line with Anxa11 stable knock-down and to establish material basis for future study.MethodsTwo Anxa11 shRNAs, shRNA-1 and shRNA-2, were synthesized, ligated to pGPU6/GFP/Neo expression plasmid and transfected into Hca-P cell. The monoclonal pGPU6/GFP/Neo-ANXA11- Hca-P cell with stable knockdown of ANXA11 was obtained by G418 screening and limited dilution. ANXA11 mRNA and protein expression levels were measured by RT-PCR and Western blot,and compared with empty vector transfected Hca-P and Hca-P control.ResultsThe recombinant expression vector pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11 was successfully constructed. The monoclonal pGPU6/GFP/Neo-ANXA11-Hca-P cell lines were obtained. Compared to normal Hca-P cell, the ANXA11 mRNA and protein level in Hca-P cells transfected with shRNA-1 wese down-regulated by about 80.2% and 77.7% with statistic significance (P<0.01).ConclusionMouse monoclonal hepatoma Hca-P cell with stable knock-down of ANXA11 was successfully constructed by RNAi and gene transfection, which provides a solid base for studying the effect and mechanism of ANXA11 in hepatoma lymphatic metastasis.

ANXA11; Lymphatic metastasis; Hca-P; RNA interference

10.11724/jdmu.2013.03.03

Q291

A

1671-7295(2013)03-0218-05

王嘉盛，劉淑清，郭春梅，等.ANXA11表達穩(wěn)定下調(diào)的肝癌Hca-P細胞株的建立[J].大連醫(yī)科大學學報，2013,35(3)：218-222.

國家自然科學基金(81171957, 81050010, 81272186)

王嘉盛(1988-)，男，廣東佛山人，碩士研究生。E-mail：carsonwang1988@gmail.com

孫明忠，教授，博士。E-mail: mxs288@gmail.com

2013-01-24；

2013-03-22)