李淑彬 ，方 茂，林曉云，鐘秀芳

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510631)

紅掌(Anthurium andraeanum)為世界熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛栽培的著名切花和盆栽觀賞花卉［1］. 紅掌生長喜陰、喜溫?zé)? 在這種條件下，極易發(fā)生微生物感染而引起侵染性病害.其中，由地毯草黃單胞菌(Xanthomonas axonopodis)引起的細(xì)菌性葉斑病(Bacterial blight)是紅掌的致命病害［1－4］.該病害最早于1960年在巴西發(fā)現(xiàn)［2］.目前世界上所有紅掌種植地區(qū)均有該病害. 我國自90年代引種栽培以來，在廣東、云南、海南等紅掌主栽省份也相繼報(bào)道該病發(fā)生，一些重病區(qū)發(fā)病率高達(dá)100%［4］.由于紅掌植物對目前使用的化學(xué)殺菌劑特別是含銅制劑極為敏感，而細(xì)菌性葉斑病菌對大多數(shù)抗生素有很強(qiáng)抗性［1－4］，對該植物病害尚無有效的防治藥物和防治措施，該病的發(fā)生是制約紅掌產(chǎn)業(yè)發(fā)展最重要因素.抗病品種的選育和種植是目前唯一有效的防治措施.

研究植物在病菌侵染后寄主防御相關(guān)生理、生化的動(dòng)態(tài)變化是了解病原菌與寄主相互作用生化機(jī)制、提高植物抗病品種選育中選擇準(zhǔn)確性和育種效率的基礎(chǔ).目前，相關(guān)研究在多種經(jīng)濟(jì)作物和果蔬植物如水稻［5］、玉米［6］、白菜［7］、香蕉［8］、芒果［9］、番茄［10］等已有大量報(bào)道.對紅掌植物在病菌侵染下防御體系的動(dòng)態(tài)變化報(bào)道尚少［11－12］.

本論文報(bào)道一株新近分離的地毯草黃單胞菌ABB－2(X. axonopodis ABB－2)對紅掌主栽品種“阿拉巴馬”(Alabamb)的致病性，并對該病菌侵染后紅掌防御相關(guān)主要生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，以期為了解紅掌與寄主相互作用生化機(jī)制、選育抗病品種提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試菌株及菌懸液接種物制備

X.axonopodis ABB－2 由本實(shí)驗(yàn)室從廣州某紅掌種植基地細(xì)菌性葉斑病紅掌典型病株葉片分離、鑒定并保藏. 保藏的X. axonopodis ABB－2 轉(zhuǎn)接到新鮮牛肉膏蛋白胨斜面，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后用無菌蒸餾水將斜面上X.axonopodis ABB－2 細(xì)胞洗下，并用無菌蒸餾水稀釋到OD600=0.6(X.axonopodis ABB－2 細(xì)胞數(shù)大約為每mL 108菌落形成單位(CFU/mL).

1.2 供試紅掌及栽培管理

健康、生長一致的紅掌主栽品種“阿拉巴馬”(Alabamb)從廣州某紅掌種植基地購買，立即單株移栽到塑料盆中，移栽基質(zhì)為m(泥炭土)∶m(沙土)=3∶1，移栽前基質(zhì)121 ℃滅菌1 h.每7 d 施用營養(yǎng)液(m(N)、m(P)、m(K)=20∶10∶20)1 次，每3 d 澆水1 次. 溫室的空氣相對濕度為80%～85%、溫度(28 ±4)℃，適應(yīng)培養(yǎng)7 d 后于華南師范大學(xué)蘭花中心溫室中開始實(shí)驗(yàn).

1.3 X.axonopodis ABB－2 對紅掌致病性研究

1.3.1 離體葉片感染試驗(yàn) 取健康紅掌植株葉片先用自來水沖洗表面雜物及灰塵，用無菌解剖刀片將葉片切成約6 cm2，放入無菌培養(yǎng)皿中(預(yù)先加入適量無菌水保持濕度)玻璃支架上. 將配好的病菌懸液(1 mL)均勻噴灑到葉片表面.無菌水處理作為正常對照，置于28 ℃、晝夜光照時(shí)間12 h/12 h 的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng). 定期觀察葉片狀況，統(tǒng)計(jì)12個(gè)重復(fù)接種葉片的病葉率(病葉數(shù)/12 ×100%).

1.3.2 盆栽感染實(shí)驗(yàn) 每株紅掌挑選3～4 片大小一致的葉片.于每一選擇的葉片正面均勻噴灑3 mL新鮮配好的菌懸液，接種后移入試驗(yàn)溫棚，用保鮮袋套袋3 d 后移去保鮮袋.按照1.2 方法進(jìn)行管理.共計(jì)接種6 盆植株22個(gè)葉片. 定期觀察植株生長狀況，統(tǒng)計(jì)每一植株的病葉數(shù)目并計(jì)算接種葉片的病葉率(病葉數(shù)/植株接種葉片數(shù)×100%)及總病葉率(病葉數(shù)/植株總?cè)~片數(shù)×100%).

1.4 病菌X. axonopodis ABB 誘導(dǎo)寄主防御相關(guān)生化指標(biāo)測定

1.4.1 病菌接種及樣品制備 按照1.3.2 的方法每株挑選2 片大小一致的葉片，用X. axonopodis ABB 接種.接種后第0、2、4、6、8、10、12、14、16 天，剪取未接種的葉片，用蒸餾水清洗干凈、濾紙吸干水后剪去葉片主脈. 參照王學(xué)奎的方法［13］，準(zhǔn)確稱取0.5 g 葉片置于預(yù)冷的研缽中，加入4 mL 預(yù)冷的0.1 mol/L pH 8.8 硼酸緩沖液(含1 mmol/L 的EDTANa2)以及少量的石英砂和聚乙烯吡咯烷酮，冰浴研磨成均漿，移至離心管中，再用2 mL 的提取緩沖液沖洗殘留部分后合并，4 ℃、11 000 r/m 離心20 min，上清液即用于分析.每個(gè)測定3個(gè)重復(fù).

1.4.2 防御相關(guān)生化指標(biāo)的測定 可溶性蛋白含量采用考馬氏亮藍(lán)染色法測定［14］，以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白質(zhì)含量，單位為每g 鮮重中蛋白質(zhì)的mg;超氧化物歧化酶(SOD)活性測定參照王學(xué)奎的方法［13］，以抑制50%NBT 光化還原為1個(gè)酶活單位(U);過氧化物酶(POD)活性測定參照王學(xué)奎的方法［13］，以愈創(chuàng)木酚－30% H2O2為底物測定，每分鐘OD 值變化0.01 為1個(gè)POD 酶活單位(U);多酚氧化酶(PPO)活性測定參照王學(xué)奎的方法［13］，以鄰苯二酚為底物測定，每分鐘OD 值變化0.01 為1個(gè)POD 酶活單位(U);苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定參照李合生的方法［15］，以L－苯丙氨酸為底物測定，以每小時(shí)內(nèi)OD290變化0.01 為1個(gè)酶活性單位(U);游離酚含量參照羅曉芳等采用Folin 酚還原法測定［16］，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)樣品建立總酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線. 樣品中游離酚含量用每g鮮組織所含沒食子酸的質(zhì)量(mg)表示(mg/g).

2 結(jié)果與分析

2.1 X.axonopodis ABB－2 對紅掌的致病性

在離體葉片試驗(yàn)中，紅掌葉片在X. axonopodis ABB－2 接種2～3 d 后，細(xì)菌性葉斑病葉部感染的典型癥狀—水漬狀病斑開始出現(xiàn)，在第4 天，所有接種的葉片均出現(xiàn)病斑，病葉率達(dá)到100%(表1).隨著離體葉片培養(yǎng)時(shí)間延長，病斑面積不斷擴(kuò)大，病斑顏色加深逐漸成灰褐色，在感染第10 天后幾乎整個(gè)葉片呈茶褐色腐爛(圖1). 盆栽感染實(shí)驗(yàn)顯示了與離體葉片感染實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)果.該病菌接種3～4 d后，被接種葉片背面出現(xiàn)水漬狀病斑，隨著感染時(shí)間的延長病斑逐漸擴(kuò)展、中心顏色轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚?從接種后第8 天開始，所有接種的葉片均出現(xiàn)病斑，接種葉片的病葉率達(dá)到100%. 且未直接接種葉片也開始出現(xiàn)病斑，在第16 d 植株中65%以上的葉片出現(xiàn)病斑.顯示X. axonopodis ABB－2 對紅掌“阿拉巴馬”具有較強(qiáng)的致病性.

表1 X.axonopodis ABB－2 接種紅掌后病葉的發(fā)生率Table 1 Percentages of leaves with lesion of A. andraenum cultivar‘Alabamb’after inoculation with X. axonopodis ABB－2

圖1 X.axonopodis ABB－2 對紅掌“阿拉巴馬”的致病性Figure 1 Pathogenicity of X.axonopodis ABB－2 on A.andraenum cultivar‘Alabamb’

2.2 X. axonopodis ABB－2 對紅掌可溶性蛋白含量的影響

在X.axonopodis ABB－2 感染后，紅掌葉片可溶性蛋白含量在首先的12 d 內(nèi)有一個(gè)持續(xù)而緩慢的增加(圖2)，在接種后的第12 天，其可溶性蛋白含量相比非接種對照所有測試的平均值增加了21.76%.隨后逐漸下降，第16 天的含量仍然顯著高于非接種對照(P ＜0.01).

圖2 X.axonopodis ABB－2 誘導(dǎo)紅掌可溶性蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化Figure 2 Changes in soluble protein content in the leaves of inoculated Anthurium plant with X.axonopodis ABB－2 and control Anthurium plant

2.3 X. axonopodis ABB－2 對紅掌SOD、POD、PPO 和PAL 活性的影響

在X.axonopodis ABB 接種后前一階段，紅掌葉片SOD 活性快速增加，侵染后第4 d 達(dá)到峰值，較非接種對照SOD 活性測定的平均值增加了15.37%;隨后急劇而持續(xù)的下降，至測試周期結(jié)束時(shí)(病菌接種后的第16 d)，其活性僅為非接種對照的55.46%(圖3A).

X.axonopodis 接種后，紅掌葉片POD 活性呈現(xiàn)于其SOD 活性相似的動(dòng)態(tài)變化(圖3B). 該病菌接種后的0～6 d，紅掌葉片POD 活性逐漸增加，在第6天達(dá)到活性峰值，較非接種對照平均值增加了36.62%，隨后緩慢持續(xù)下降，在第12 天其活性下降到與非接種對照接近. 而在測試周期結(jié)束時(shí)(病菌接種后的第16 天)，POD 活性下降到僅為非接種對照73.36%的水平.

X.axonopodis 接種同樣誘導(dǎo)了PPO 活性的升高，其活性峰值出現(xiàn)在該病菌感染后的第8 天，其較非接種對照平均值增加了51.89%(圖3C).隨后逐漸下降，至測試周期結(jié)束時(shí)(病菌接種后的第16天)，PPO 活性回復(fù)到接種前的水平.

X.axonopodis ABB 接種后紅掌葉片PAL 活性一直呈現(xiàn)出平穩(wěn)增加的狀態(tài)，其活性峰值出現(xiàn)在病菌感染后的第12 天，其活性與接種前比較增加了66.43%(圖3D).隨后逐漸下降，但在測試周期結(jié)束的最后一天(第16 天)，該酶活性仍然顯著高于非接種對照(P ＜0.01).

2.4 X. axonopodis ABB－2 對紅掌游離酚含量的動(dòng)態(tài)變化

X.axonopodis ABB 接種后測試周期，紅掌葉片游離酚含量一直呈現(xiàn)平穩(wěn)增加的狀態(tài)(圖4)，接種后16 d，其含量較對照增加了34.66%.

3 討論

本研究中，X. axonopodis ABB－2 接種紅掌“阿拉巴馬”后，葉片呈現(xiàn)典型的細(xì)菌性葉斑病葉部感染癥狀，且病情發(fā)展迅速(圖1、表1).此外，該病菌接種后，不僅引起紅掌葉部感染，而且其花絮也出現(xiàn)黑褐色病斑(結(jié)果未顯示). 這些結(jié)果說明X. axonopodis ABB－2 為紅掌細(xì)菌性葉斑病的強(qiáng)毒病原，與該病菌分離自紅掌“阿拉巴馬”細(xì)菌性葉斑病典型病株一致.

圖3 X.axonopodis ABB－2 誘導(dǎo)寄主紅掌不同酶活性的動(dòng)態(tài)變化Figure 3 Changes in different enzyme activities in the leaves of inoculated Anthurium plant with X.axonopodis ABB－2 and control Anthurium plant

圖4 X.axonopodis ABB－2 誘導(dǎo)寄主紅掌游離酚含量的動(dòng)態(tài)變化Figure 4 Changes in free phenol content in the leaves of inoculated Anthurium plant with X. axonopodis ABB－ 2 and control Anthurium plant

SOD 和POD 是植物細(xì)胞內(nèi)抵御活性氧(Reactive oxygen species，ROS)傷害的2 種主要保護(hù)酶，其活性變化可間接反映植物體內(nèi)活性氧代謝的變化，也常作為植物抗病性的重要指標(biāo)［5－8，17］. 植物受到病害侵染后，會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，ROS 的積累將激發(fā)植株體內(nèi)抗氧防御相關(guān)合成酶基因的表達(dá)，表現(xiàn)為抗氧化酶活性上升. 在本研究中，X. axonopodis ABB－2 感染紅掌“阿拉巴馬”后同樣誘導(dǎo)了寄主紅掌葉片SOD 和POD 的增加，間接說明該病菌感染引起了“阿拉巴馬”紅掌植株ROS 的迸發(fā). ROS 迸發(fā)是植物受到病原菌侵害時(shí)，最快的防衛(wèi)反應(yīng)之一［17］.X.axonopodis ABB－2 感染紅掌“阿拉巴馬”后，隨著感染時(shí)間的延長，病情發(fā)展加劇，而被感染的植株葉片SOD 和POD 活性在感染的中后期迅速而持續(xù)下降到低于非接種對照的水平. 這個(gè)結(jié)果提示ROS 迸發(fā)并不足以殺死紅掌所感染的X.axonopodis ABB－2 病菌，相反，該病菌在該植株內(nèi)的增殖破壞了該植株的抗氧化防御系統(tǒng)，使之活性顯著降低.過多的活性氧積累對植物也具有嚴(yán)重的毒害作用，甚至導(dǎo)致細(xì)胞或植株死亡［17］. 本研究的結(jié)果也初步提示感染后活性氧產(chǎn)生與清除動(dòng)態(tài)平衡的破壞可能也是X.axonopodis 對紅掌致病性的因素之一.

多酚氧化酶可催化木質(zhì)素及其它酚類氧化產(chǎn)物的形成而發(fā)揮抗病作用［8］.苯丙氨酸解氨酶是苯丙氨酸代謝的第一關(guān)鍵酶，與包括木質(zhì)素、香豆素、黃酮、類黃酮衍生物等在內(nèi)的植物抗毒素的合成密切相關(guān)［18］.對PAL、PPO 與植物抗病性的關(guān)系，大多報(bào)道認(rèn)為該二種酶在植株受病原菌侵染后其活性升高，并與抗病性呈正相關(guān)［5－10］. 在本研究中，X. axonopodis ABB－2 感染紅掌“阿拉巴馬”后，紅掌葉片PPO 活性升高達(dá)到一個(gè)峰值后下降到非接種對照植株水平，與大多數(shù)報(bào)道一致.而該病菌感染后紅掌葉片PAL 活性達(dá)到最大值，且該酶維持高活性的時(shí)間明顯大于其他所測試的防御相關(guān)酶，提示該病菌誘導(dǎo)紅掌PAL 活性的提高可能是紅掌抗細(xì)菌性葉斑病的重要因素.植物細(xì)胞內(nèi)存在的酚類化合物可通過抑制病菌生長、病原物毒素及酶的產(chǎn)生或使其鈍化等多種方式參與對病原的抵御. 本研究中，病菌X.axonopodis ABB 接種誘導(dǎo)了紅掌葉片游離酚含量持續(xù)的增加. 稻黃單胞菌菌侵染寄主水稻后也引起寄主游離酚含量顯著增加，與目前的研究結(jié)果一致［5］.

病程相關(guān)蛋白(PRP)是植物受病原物或不同因子刺激、脅迫所產(chǎn)生的一類具有廣譜抗性的可溶性蛋白質(zhì).植物在病原脅迫下組織中可溶性蛋白含量的變化可間接反映PRP 的變化.本研究中，病菌X.axonopodis ABB 接種后紅掌葉片可溶性蛋白含量其最大值較非接種對照增加了21.76%，提示該病菌感染可誘導(dǎo)紅掌PRP 的表達(dá).但該病菌接種后紅掌PRP 中各個(gè)成員的表達(dá)及其差異有待進(jìn)一步驗(yàn)證和研究.

革蘭氏陰性病原細(xì)菌大多能分泌Harpin 類蛋白，許多研究發(fā)現(xiàn)該類蛋白能激活寄主、非寄主抗病防衛(wèi)、生長防御相關(guān)的多條信號(hào)途經(jīng)［19］. 在前期工作中作者發(fā)現(xiàn)X.axonopodis ABB－2 能合成Harpin蛋白.X.axonopodis ABB－2 誘導(dǎo)寄主紅掌抗病、防御相關(guān)生化指標(biāo)的升高是否由Harpin 蛋白介導(dǎo)有待進(jìn)一步研究.

［1］GANTAIT S，MANDAL N. Tissue culture of Anthurium andreanum:A significant review and future prospective［J］. Int J Bot，2009，201，6:207－219.

［2］LAURENT P，CHABIRAND A，JOUEN E，et al. A new semi－selective medium for the isolation of Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae，the etiological agent of anthurium bacterial blight［J］. Lett Appl Microbiol，2009，49(2):210－216.

［3］KELANIYANGODA D B，DWICKRAMARATHNE M S.Development of pre－ detection technique for bacterial blight (Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae)disease in Anthurium to produce healthy planting materials［J］. Archives of Phytopathology and Plant Protection，2009，7:643－649.

［4］盧夢玲，周曉云，曾偉達(dá)，等. 紅掌細(xì)菌性疫病病原菌的PCR 特異性檢測［J］. 植物病理學(xué)報(bào). 2012，42(1):1－9.

［5］SHARMA N，KAUR C，JAGJIT S，et al. Biochemical responses associated with bacterial blight of rice (Oryza sativa)［J］. Archives of Phytopathology and Plant Protection，2012，45(1):47－61.

［6］VARGAS W A，SANZ－ MARTíN J M，RECH G E.Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development Colletotricum graminicola in maize［J］. Plant Physiology，2012，doi:http://dx.doi.org/10.1104/pp.111.190397.

［7］王利英，侯喜林，劉琳，等. 甘藍(lán)鏈格孢菌侵染對白菜保護(hù)酶活性和H2O2含量的影響［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2008，35(7):1065－ 1068.

［8］李赤，黎永堅(jiān)，于莉. 香蕉枯萎病菌對不同香蕉品種防御酶系的影響［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26(17):251－255.

［9］LIN J H，GONG D Q，ZHU S J，et al. Expression of PPO and POD genes and contents of polyphenolic compounds in harvested mango fruits in relation to enzothiadiazole－induced defense aga inst anthracnose［J］. Scientia Horticulturae，2011，26(1):85－89.

［10］李琳琳，李天來，余朝閣，等. 鈣素對SA 誘導(dǎo)番茄幼苗抗灰霉病的調(diào)控作用［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2012，39(2):273－280.

［11］高惠蘭，柳振譽(yù)，葉靜水，等. 冷鍛煉對低溫脅迫下紅掌葉片膜脂過氧化及保護(hù)酶活性影響［J］. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，20(2):108－112.

［12］田丹青，葛亞英，潘剛敏，等. 低溫脅迫對3個(gè)紅掌品種葉片形態(tài)和生理特性的影響［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2011，38(6):1173－1179.

［13］王學(xué)奎. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)［M］. 北京:高等教育出版社，2006.

［14］BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein2dye binding［J］. Analytical Biochemistry，1976，172:248－254.

［15］李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)［M］.第1 版.北京:高等教育出版社，2000.

［16］羅曉芳，田硯亭，姚洪軍. 組織培養(yǎng)過程中PPO 活性與總酚含量的研究［J］. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21(1):92－95.

［17］FONES H，PRESTON G M. Reactive oxygen and oxidative stress tolerance in plant pathogenic Pseudomonas［J］. FEMS Microbiology Letters，2012，327:1－8.

［18］MACDONALD M J，D'CUNHA G B. A modern view of phenylalanine ammonia lyase［J］. Biochem Cell Biol，2007，85:273－282.

［19］REN H Y，GU G，LONG J. Combinative effects of a bacterial type－III effector and a biocontrol bacterium on rice resistance［J］. J Biosci，2006，31:617－627.