谷 峻 ，張靜苗，張碧瑤，馬杏賢，李良冰，吳燕玲

(華南師范大學生命科學學院，廣東廣州510631)

廣金錢草(Desmodium styracifolium)是豆科植物山螞蝗屬中的一種，其干燥地上部分為常用傳統(tǒng)中藥，收載于中華人民共和國藥典［1］，其味甘、性涼、具有清熱和利尿的功效，可用于治療泌尿系統(tǒng)感染、尿路結石和膽石癥等. 廣金錢草主產于廣東、廣西、海南等地［1］. 近些年隨著其療效被確認，對廣金錢草需求量逐年增加，使得其野生資源不斷減少.也是目前中藥材生產的主要方法. 隨著廣金錢草的連年種植，病害發(fā)生日益嚴重［2］. 迄今為止，國際上對重要的土傳病害還沒有十分有效的防治方法，然而伴隨著土壤微生物分子生態(tài)學技術的發(fā)展，研究者提出利用土壤中的有益微生物種群與有害微生物的競爭、拮抗、捕食等生態(tài)學關系，使有益微生物類群占據有利的生態(tài)位，可能是控制土傳病害的有效途徑［3－5］.根瘤菌作為與豆科植物共生的一類有益微生物類群，一旦與宿主建立共生體后，能夠為宿主提供生長必需的氮素營養(yǎng)，增加宿主的抗逆性.然而目前國內外對廣金錢草根瘤菌的研究還未見報道.

篩選抗逆性強的根瘤菌菌株是獲得優(yōu)良的豆科植物－生物固氮共生體系的前提，本文研究了廣金錢草根瘤菌對不同鹽度、溫度、酸堿度和重金屬耐受性等生物學特性.BOX－PCR 是一項可靠的、相對穩(wěn)定的基于基因組水平的指紋圖譜分析手段，它是根據廣泛存在于細菌基因組中的短重復序列(BOX)的保守性來設計引物并擴增位于重復序列間的不同片段，近年來被廣泛地用于高效根瘤菌菌株的田間篩選標記［6－8］. 獲得的結果能進一步明確廣金錢草根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育地位和遺傳多樣性，本研究選取代表菌株測定了其recA 基因序列并進行系統(tǒng)發(fā)育分析.為進一步篩選與廣金錢草共生的高效固氮體系，提高廣金錢草的產量和品質提供優(yōu)良的種質資源.

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

PCR 試劑及轉化試劑均購自大連寶生物公司，Axygen 凝膠回收試劑盒和DNA 提取試劑盒分別購自誼橋生物科技公司及美津生物科技有限公司(廣州). PTC100 PCR 擴增儀(MJ Research 公司，美國)，高速冷凍離心機Eppendorf 5417R (Eppendorf，美國). 本研究使用的引物由北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司合成，BOX－PCR 所用引物序列為5’－ CTACGGCAAGGCGACGCTGACG－3’［9］，recA 基 因 擴 增 引 物 為41F5’－ TTCGGCAAGGGMTCGRTSATG－ 3’，640R5’－ ACATSACRCCGATCTTCATGC－3’［10］.

1.2 供試菌株

采用土壤捕捉法獲得根瘤，土壤為磚紅壤，pH值5.5;在實驗室條件下將獲得的新鮮根瘤經體積分數為75%的乙醇表面消毒1 min，經質量分數為0.1%的氯化汞溶液浸泡1 min 后，無菌水沖洗3次，將根瘤切開后在YMA 平板上劃線分離，于28～30 ℃培養(yǎng)7～10 d，將長出的根瘤菌經平板劃線和顯微鏡鏡檢后，獲得根瘤菌純菌株并接種YMA 斜面培養(yǎng)后，4 ℃冰箱保藏備用. 將分離的菌株經活化后，收集新鮮菌體回接于經低氮培養(yǎng)液生長的廣金錢草植株上，經結瘤試驗確定為廣金錢草根瘤菌.供試菌株及參比菌株見表1，其中慢生參比菌株由中國農業(yè)大學生物學院陳文新課題組饋贈.

本研究所用的廣金錢草種子購買于廣東南方中藥材種苗基地.

表1 供試菌株一覽表Table 1 The rhizobial strains used in this study

1.3 供試菌株的抗逆性測定

供試菌株經YMA 平板活化后，接種至各YMA供試平板上.耐鹽試驗NaCl 的終質量分數(下同)為1.0%～4.0%;pH 耐受試驗分別為4、5、9、10、11.溫度耐受性分別于4、10、40 ℃培養(yǎng)5～15 d，觀察并記錄結果;在YMA 培養(yǎng)基中分別添加重金屬Zn2+，Cu2+，Pb2+，及Zn2+/ Pb2+的組合至終濃度為4 mmol/L，測定供試菌株對不同重金屬的耐受性.接種后于28 ℃黑暗培養(yǎng)7～10 d、觀察和記錄菌株生長情況.

1.4 遺傳多樣性分析

1.4.1 總DNA 的提取 供試菌株經YMA 斜面活化后，接種于5 mL YMA 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)5～7 d，取1.5 mL 菌液于10 000 r/min 收集菌體，按照試劑盒說明書提取總DNA，用紫外分光光度計測定提取的DNA 濃度，使用前經稀釋至50 ng/μL.

1.4.2 BOX－PCR 指紋圖譜分析 PCR 擴增反應按文獻［11］的要求加入PCR 反應各組分，按PCR循環(huán)程序進行擴增. 取8～10 μL PCR 產物經質量分數1.5%瓊脂糖電泳確定擴增效果. 在凝膠成像儀中掃描凝膠，將指紋圖譜用TIFF 文件保存. 圖像信息利用GelcomparII(version 3.5)分析軟件，采用平均連鎖法(UPGMA)聚類，最后得到供試菌株和參比菌株的聚類樹狀圖［12］.

1.4.3 recA 基因擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析 recA 基因擴增程序:95 ℃3 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，35個循環(huán)，72 ℃5 min. 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物長度，經凝膠回收純化后，與載體pMD18－T 連接，采用熱激法轉化到大腸桿菌DH5α中，采用藍白斑法和PCR 法檢測陽性克隆. 將獲得的陽性克隆送至北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分部測序. 將測序獲得recA 基因序列及Gen-Bank 中獲得的根瘤菌參比菌株的相應基因序列經Clustal X 軟件序列比對后，采用Mega4.0 軟件中的鄰接法(Neighbor－joining)進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，自展值(bootstrap)為1 000［12］.

2 結果與分析

2.1 根瘤菌對不同鹽度、pH 和溫度的耐受性

供試菌株均能夠在含有質量分數(下同)為1%NaCl 的YMA 平板上生長，僅有2 株菌能夠耐受2%NaCl，所有的供試菌在高于3%NaCl 的YMA 平板上無法生長(表2)，在pH 5 和pH 9 的條件下能夠生長，pH 4 和pH 10 的YMA 上不能生長. 此外，供試菌株對不同溫度表現出了不同的耐受性，分別有4株和10 株根瘤菌在4 ℃和10 ℃條件下能夠生長，僅有1 株供試菌在40 ℃下生長.

表2 供試菌株在不同NaCl、pH 及溫度下的生長情況Table 2 The growth of the tested strains in different NaCl、pH and temperatures

2.2 根瘤菌對不同重金屬的耐受性

供試菌株對4 mmol/L 的Zn2+、Pb2+及Pb2+/Zn2+均有很好的耐受性(表3). 2 株廣金錢草根瘤菌能夠在含有4 mmol/L Cu2+的YMA 平板上生長.廣金錢草根瘤菌菌株對重金屬Pb2+、Zn2+的耐受性要強于Cu2+的耐受性.

表3 供試菌株對不同重金屬的耐受性Table 3 The resistance of the tested strains to different heavy metals

2.3 廣金錢草根瘤菌的BOX－PCR 指紋圖譜分析

對14 株廣金錢草根瘤菌和6 株慢生根瘤菌參比菌株進行了指紋圖譜擴增和聚類分析(圖1)，在79%的相似水平上，有12 株慢生廣金錢草根瘤菌的BOX－PCR 指紋圖譜與參比菌株埃氏慢生根瘤菌(B.elkanii)在90%的相似水平上聚類形成1個分支，表明與廣金錢草共生的慢生根瘤菌在基因組水平上與埃氏慢生根瘤菌B.elkanii 更為相近.在91%的相似水平上該分支可分成3個亞分支，其中亞分支1 由5 株廣金錢草慢生根瘤菌構成，亞分支2 由4株廣金錢草根瘤菌和1 株參比菌株埃氏慢生根瘤菌B.elkanii 聚群，另有3 株慢生根瘤菌構成亞分支3.而其余2 株廣金錢草根瘤菌未與已知的參比菌株聚在一起.

圖1 廣金錢草根瘤菌BOX－PCR 指紋圖譜聚類分析Figure 1 The cluster analysis of BOX－PCR fingerprinting for the rhizobia nodulated with D. styracifolium

2.4 基于recA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

recA 基因編碼細菌DNA 重組蛋白的α 亞基，與細菌修復系統(tǒng)發(fā)揮功能相關. 由于該基因編碼的蛋白功能相對保守，被用于慢生根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育研究中.作者在BOX－PCR 指紋圖譜分析基礎上，選取各亞分支的代表菌株進行recA 基因的克隆和測序，測序后得到的基因序列長度均大于500 bp，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2).

測序的供試9 株代表菌株中，共有8 株菌位于B.elkanii 和B.pachyrhizi 構成的系統(tǒng)發(fā)育分支上，其中3 株慢生根瘤菌SCNU2、SCNU5 和SCNU6 位于B.elkanii 系統(tǒng)發(fā)育亞分支上，菌株SCNU2 和SCNU5的序列同源性為100%，慢生根瘤菌SCNU4、SCNU7和SCNU13 位于B. pachyrhizi 系統(tǒng)發(fā)育亞分支上;慢生根瘤菌SCNU3 和SCNU9 雖然位于B.elkanii 和B. pachyrhizi 構成的系統(tǒng)發(fā)育發(fā)育分支上，但各自成為1個獨立的亞分支;僅有1 株菌位于快生型根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育分支上，與已知種Rhizobium leguminosarum USDA2671T序列同源性高，約為90%.

圖2 以recA 基因部分序列構建的廣金錢草根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree of recA gene showing the relationships among therhizobial isolates from Desmodium styacifolium and the related species

3 討論

近年來，隨著廣金錢草規(guī)范化種植基地的建立，已經對廣金錢草種植中的種質資源、生物學特性、種植技術、田間管理及藥材質量評價等問題開展研究，并制定出了規(guī)范化生產標準操作規(guī)程［13－15］. 然而，與廣金錢草共生的根瘤菌對宿主在生長過程中及最終藥材品質的影響幾乎未有涉及，并且對廣金錢草根瘤菌的資源也未見報道. 筆者之前的研究發(fā)現，分布于我國不同地區(qū)的山螞蝗屬豆科植物的根瘤菌主要以慢生根瘤菌為主，其中埃氏慢生根瘤菌為優(yōu)勢種群［12］.前期的研究未涉及宿主山螞蝗屬中的廣金錢草根瘤菌的資源狀況.本研究結果發(fā)現，在華南地區(qū)的磚紅壤中與廣金錢草共生的根瘤菌也多與埃氏慢生根瘤菌親緣關系近，recA 基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，3 株慢生根瘤菌位于埃氏慢生根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育分支，另有2 株處于獨立的系統(tǒng)發(fā)育分支，可能代表新的慢生根瘤菌種群，需要進一步擴大種群來確定.

與分離自其它宿主豆科植物的根瘤菌相比，本研究分離到的廣金錢草根瘤菌對鹽的耐受性普遍較弱，這一結果與分離自不同地區(qū)山螞蝗屬其它種宿主植物的根瘤菌耐鹽性一致［16－17］. 徐開未等［16］研究分離自金沙江干熱河谷區(qū)的山螞蝗屬根瘤菌抗逆性時發(fā)現，山螞蝗屬根瘤菌有較強的抗低溫和抗熱的能力;本研究表明廣金錢草根瘤菌對低溫的耐受性較強而對高溫的耐受性弱，僅1 株菌能夠在40 ℃生長，其它根瘤菌均無法耐受40 ℃. 重金屬耐性分析表明，廣金錢草根瘤菌對不同重金屬有良好的耐受性和抗性，并且對鋅、鉛單鹽和其雙鹽在4 mmol/L 下都有很好的耐受性，這與繆?？〉龋?7］的研究結果較一致.

此外，本研究采用了BOX－PCR 技術對廣金錢草根瘤菌的遺傳多樣性進行分析，一方面揭示了廣金錢草根瘤菌在基因組水平上的多樣性，同時也為下一步田間篩選高效生物固氮體系提供了依據. 由于本研究中分離到的廣金錢草根瘤菌絕大多數為慢生型，而慢生根瘤菌的16S rDNA 基因序列相似性很高，很難很好的將不同種慢生根瘤菌區(qū)分開［18］，因此采用了recA 基因序列分析技術對獲得的廣金錢草根瘤菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析.BOX－PCR 分析發(fā)現供試的14 株菌中有12 株菌在基因組水平上與埃氏慢生根瘤菌相似，而recA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析將在BOX－PCR 分析中聚群的菌株區(qū)分開.已有報道認為BOX－PCR 不適用于種群劃分及種屬的界定［8］，本研究結果表明BOX－PCR 技術對慢生根瘤菌不同種群的劃分結果與recA 基因序列分析獲得的結果較一致. 這可能與作者采用土壤捕捉法獲得慢生根瘤菌有關，及分析的種群數量較少造成的，需要進一步擴大種群數量來比較分析.

致謝:感謝華南師范大學生命科學學院馮啟理教授提供儀器以及中國農業(yè)大學生物學院陳文峰副教授幫助聚類分析.

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