尹寶慧，賈秀紅，李建廠

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東 濱州 256603

白血病的發(fā)病率在兒童惡性腫瘤中占首位，對(duì)其治療主要是以化療為主的綜合治療，但多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）常導(dǎo)致化療失敗。MDR是腫瘤細(xì)胞對(duì)某一化療藥物產(chǎn)生耐藥性后，對(duì)其他化學(xué)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。凋亡誘導(dǎo)的耐藥是白血病復(fù)雜的耐藥機(jī)制之一，某些基因過(guò)表達(dá)通過(guò)改變白血病細(xì)胞執(zhí)行程序性死亡的能力或改變細(xì)胞凋亡通路而誘導(dǎo)耐藥。研究表明，在白血病發(fā)生中，同源盒基因（homeobox gene，HOX）A7過(guò)表達(dá)能抑制白血病細(xì)胞凋亡，且HOXA7過(guò)表達(dá)與白血病患者對(duì)化療的抵抗性有關(guān)[1,2]。因此預(yù)測(cè)，抑制HOXA7過(guò)表達(dá)有望提高白血病對(duì)化療的敏感性，在一定程度上逆轉(zhuǎn)白血病MDR。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的能高效、特異性沉默靶基因的技術(shù)。本研究運(yùn)用RNAi抑制白血病U937細(xì)胞中HOXA7表達(dá)后，檢測(cè)U937細(xì)胞對(duì)化療藥物阿糖胞苷（cytarabine，Ara-C）和高三尖杉酯堿（homoharringtonine，HHT）敏感性的變化，為探討RNAi逆轉(zhuǎn)白血病MDR提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株U937由濱州醫(yī)學(xué)院腫瘤分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自德國(guó)Roche公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自加拿大Fermentas公司；RNAiso Plus總RNA提取試劑和PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；兔抗人β-actin多克隆抗體購(gòu)自南京巴傲得生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人HOXA7多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；HOXA7和內(nèi)參β-actin引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；靶向HOXA7基因的特異性小發(fā)夾RNA（small hair RNA，shRNA）及陰性對(duì)照RNA和空載體質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成或提供；注射用Ara-C購(gòu)自哈爾濱博萊制藥有限公司；注射用HHT購(gòu)自北京協(xié)和藥廠；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 U937細(xì)胞培養(yǎng) 人白血病細(xì)胞株U937在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素雙抗的完全培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，2～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 U937細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 本課題前期實(shí)驗(yàn)中根據(jù)HOXA7基因序列，設(shè)計(jì)并合成3對(duì)靶向HOXA7基因的特異性shRNA，并篩選出對(duì)HOXA7表達(dá)抑制效率最佳的1對(duì)shRNA（引物序列：正義鏈5’-CCTCCTACGACCAAAACAT-3’，反義鏈5’-ATGTTTTGGTCGTAGGAGG-3’），由此shRNA序列設(shè)計(jì)并合成靶向HOXA7基因的特異性真核表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7；同時(shí)設(shè)計(jì)并合成陰性對(duì)照載體pGPU6/GFP/Neo-shNC，作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染前取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮后，以6×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板。根據(jù)X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7和pGPU6/GFP/Neo-shNC分別用不含抗生素和血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋，混勻后取X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋好的重組載體中，混勻后室溫孵育30 min，小心將混合物加到U937細(xì)胞中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后加G418（800 μg/mL）進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞篩選，4周后用G418（400 μg/mL）維持培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達(dá)pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7和pGPU6/GFP/Neo-shNC的U937細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。后續(xù)實(shí)驗(yàn)分3組：實(shí)驗(yàn)組（穩(wěn)定表達(dá)pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7的U937細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（穩(wěn)定表達(dá)pGPU6/GFP/Neo-shNC的U937細(xì)胞）和空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞），即收集以上3組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中HOXA7 mRNA表達(dá)情況 分別收集各組細(xì)胞，運(yùn)用RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA純度及濃度。兩步法進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)HOXA7 mRNA的表達(dá)情況。所用引物序列如下：HOXA7正義鏈為5’-ACCGACACTGAAAGCTGCCG-3’，反義鏈為 5’-AGGTCCTGAAGACCGCATCC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為410 bp；β-actin正義鏈為5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，反義鏈為 5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為268 bp。按下列條件進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用Tanon Gel凝膠圖像分析軟件，在mRNA水平計(jì)算各組細(xì)胞中HOXA7的相對(duì)表達(dá)量。HOXA7 mRNA相對(duì)水平＝HOXA7灰度值/β-actin灰度值×100%。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中HOXA7蛋白表達(dá)情況 分別收集各組細(xì)胞，應(yīng)用RIPA＋PMSF裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。蛋白與5×SDS-PAGE上樣緩沖液混合（體積比為5：1）后，95 ℃煮樣10 min，取40 μg蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE分離，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加入含7%脫脂奶粉的TBST封閉液并置于搖床上封閉2.5 h。加入兔抗人HOXA7多克隆抗體（稀釋比例為1：100），4 ℃搖床過(guò)夜，經(jīng)TBST充分漂洗（10 min/次，共洗3次），再加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為1：5000），室溫?fù)u床上放置2 h后洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯色。用兔抗人β-actin多克隆抗體（稀釋比例為1：3000）作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。采用Chemiscope軟件分析圖像，在蛋白質(zhì)水平計(jì)算各組細(xì)胞中HOXA7的相對(duì)表達(dá)量。HOXA7蛋白相對(duì)表達(dá)量＝HOXA7灰度值/β-actin灰度值×100%。

1.6 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)Ara-C和HHT的敏感性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，以3×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板上，調(diào)整培養(yǎng)液終體積為200μL。分別將不同濃度的Ara-C（終質(zhì)量濃度分別為 0、0.1、1、10、100和 1000 μg/mL）和HHT（終質(zhì)量濃度分別為0、0.05、0.5、5、50和500 μg/mL）加入各組細(xì)胞培養(yǎng)液中，每組設(shè)3個(gè)平行孔。加藥48 h后，每孔加入MTT 20μL（5 mg/mL），繼續(xù)置于 37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，離心并小心吸出孔中培養(yǎng)液，加入DMSO 150μL/孔，搖床上避光振蕩15～20 min。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在560 nm處的吸光度（D560）值，分別計(jì)算Ara-C和HHT對(duì)各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half-inhibitory concentration，IC50）。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7 FITC-PI標(biāo)記的FCM法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，以6×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板，調(diào)整培養(yǎng)液終體積為1.5 mL。每組中再設(shè)未加藥組（加等量完全培養(yǎng)液）、Ara-C組（終質(zhì)量濃度為10 μg/mL）和HHT組（終質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL），加藥48 h后離心收集細(xì)胞（2000 r/min離心5 min），PBS洗滌細(xì)胞 2次（2000 r/min離心5 min），再加入500μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，然后加AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI）各5μL，室溫避光反應(yīng)15 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率 經(jīng)G418穩(wěn)定篩選后，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞。因重組質(zhì)粒載體pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7和pGPU6/GFP/Neo-shNC均帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因，因此如預(yù)期，觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞均有綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率在70%以上，而空白對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)綠色熒光（圖1）。

2.2 pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7轉(zhuǎn) 染 能 有 效抑制HOXA7 mRNA和蛋白的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中HOXA7 mRNA的相對(duì)水平分別如下：實(shí)驗(yàn)組（23.910±1.662）%，陰性對(duì)照組（81.579±0.310）%，空白對(duì)照組（82.232±0.511）%。實(shí)驗(yàn)組明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05），而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞中HOXA7 mRNA相對(duì)水平無(wú)明顯差異（P＞0.05，圖 2A）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中HOXA7蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組HOXA7蛋白相對(duì)表達(dá)量為（25.980±1.651）%，明顯低于陰性對(duì)照組的（72.885±0.762）%和空白對(duì)照組的（73.669±1.066）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞中HOXA7蛋白相對(duì)表達(dá)量比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2B）。

Fig.1 The leukemia U937 cells after different transfections were selected by G418 and observed under a light microscope(A-C) and a fluorescence microscope (D-F) (×200).A and D: U937 cells without transfection as a blank control group;B and E: U937 cells transfected with pGPU6/GFP/Neo-shNC (a negative control small-hair RNA) vector as a negative control group; C and F: U937 cells transfected with pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7 (a small-hair RNA targeting HOXA7 gene) vector as a experimental group.The results showed that GFP (green fluorescent protein) displaying green fuorescence in U937 cells after transfection with pGPU6/GFP/Neo-shNC and pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7, and the transfection efficiencies of the two groups were more than 70%.圖1 顯微鏡下觀察經(jīng)G418穩(wěn)定篩選后各組白血病U937細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

Fig.2 The expressions of HOXA7 mRNA and protein in U937 cells transfected with shHOXA7 (small-hair-RNA targeting HOXA7 gene) were detected by RT-PCR (A)and Western blotting (B), respectively.1: Blank control group (U937 cells without transfection); 2: Negative control group (U937 cells transfected with pGPU6/GFP/Neo-shNC vector); 3: Experimental group (U937 cells transfected with pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7 vector).The results showed that both HOXA7 mRNA and protein expressions were significantly decreased in the U937 cells transfected with shHOXA7 (P＜0.05, P＜0.01, n=3).圖2 RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HOXA7基因特異性shRNA的U937細(xì)胞中HOXA7 mRNA和蛋

以上結(jié)果提示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含有HOXA7基因特異性shRNA的重組表達(dá)質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7的U937細(xì)胞系構(gòu)建成功，該載體能在mRNA和蛋白水平有效抑制HOXA7基因的表達(dá)，而陰性對(duì)照質(zhì)粒pGPU6/GFP/NeoshNC不能抑制HOXA7表達(dá)。因此，選取實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT法檢測(cè)RNAi抑制HOXA7表達(dá)后細(xì)胞對(duì)Ara-C和HHT的敏感性變化 MTT結(jié)果（圖3）顯示：在不同濃度的Ara-C和HHT作用下，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞增殖均受到抑制，且隨著藥物濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率增加；相同藥物濃度下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率高于2個(gè)對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組中Ara-C的IC50為（3.063±0.570）μg/mL，明顯低于陰性對(duì)照組的（10.863±0.740）μg/mL和空白對(duì)照組的（11.282±1.733）μg/mL（P＜ 0.05），而后兩組比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組中HHT的IC50為（0.059±0.031）μg/mL，明顯低于陰性對(duì)照組的（0.514±0.035）μg/mL和空白對(duì)照組的（0.564±0.098）μg/mL（P＜0.05），而后兩組比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組Ara-C和HHT的IC50與對(duì)照組相比，分別降低了3.5倍和8.5倍。以上結(jié)果表明，RNAi抑制HOXA7表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)Ara-C和HHT的敏感性明顯增加。

Fig.3 The inhibitory effects of Ara-C (cytarabine, in Fig.3A) and HHT (homoharringtonine, in Fig.3B) on the proliferation of U937 cells transfected with shHOXA7 (small-hair RNA targeting HOXA7 gene) were detected by MTT method.Blank control group: U937 cells without transfection; Negative control group: U937 cells transfected with pGPU6/GFP/Neo-shNC vector; Experimental group: U937 cells transfected with pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7 vector.The results showed that the inhibition effect of cellular proliferation in each group after treatment with Ara-C or HHT was gradually enhanced in a dose-dependent manner.The inhibition rate of the U937 cells transfected with shHOXA7 was significantly higher than that of the control cells exposed to the same concentration of Ara-C or HHT (P＜0.05, n=3).圖3 MTT法檢測(cè)HOXA7基因特異性shRNA轉(zhuǎn)染后U937細(xì)胞對(duì)Ara-C和HHT的敏感性變化

Fig.4 The apoptosis of U937 cells transfected with shHOXA7 (small-hair RNA targeting HOXA7 gene) after treatment with Ara-C (cytarabine) or HHT (homoharringtonine) was detected by FCM (flow cytometry).Blank control group:U937 cells without transfection; Negative control group: U937 cells transfected with pGPU6/GFP/Neo-shNC vector;Experimental group: U937 cells transfected with pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7 vector.The results showed that Ara-C or HHT could induce the apoptosis of U937 cells transfected with shHOXA7, as compared with those in the blank control and the negative control groups (P＜0.05,n =3).圖4 FCM法檢測(cè)HOXA7基因特異性shRNA轉(zhuǎn)染后U937細(xì)胞在Ara-C或HHT作用下的凋亡情況

2.4 FCM法檢測(cè)RNAi抑制HOXA7表達(dá)后細(xì)胞的凋亡情況 FCM法檢測(cè)結(jié)果（圖4）顯示：未加化療藥物時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而后兩組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），表明RNAi抑制HOXA7表達(dá)能在一定程度上促進(jìn)U937細(xì)胞凋亡；加化療藥物Ara-C和HHT作用后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05），后兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明，RNAi抑制HOXA7表達(dá)后，能在一定程度上促進(jìn)U937細(xì)胞凋亡，且能增強(qiáng)Ara-C和HHT對(duì)U937細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

3 討 論

HOX基因在控制胚胎發(fā)育和造血細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。Gaspar等[3]在兒童高分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤研究中發(fā)現(xiàn)，HOX基因高表達(dá)與患者預(yù)后差有關(guān)，且其高表達(dá)可作為患者對(duì)替莫唑胺耐藥的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)。HOXA7是HOX基因家族中的重要一員，其異常表達(dá)與白血病的關(guān)系近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。白血病致病相關(guān)基因MLL和NUP98等可與多種易位基因形成融合蛋白，通過(guò)上調(diào)HOXA7基因表達(dá)，從而導(dǎo)致白血病的發(fā)生。在慢性粒細(xì)胞白血病急淋變過(guò)程中，白血病細(xì)胞惡性克隆常伴有HOXA7基因的異常高表達(dá)，說(shuō)明其作為原癌基因在白血病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。另外，HOXA7異常表達(dá)與白血病的治療和預(yù)后也密切相關(guān)。Drabkin等[1]研究證明，HOXA7過(guò)表達(dá)與急性骨髓性白血病患者對(duì)化療的反應(yīng)差及預(yù)后不佳有關(guān)。Afonja等[4]研究發(fā)現(xiàn)，HOXA7高表達(dá)的白血病患者表現(xiàn)為對(duì)化療藥物誘導(dǎo)凋亡的抵抗增強(qiáng)，而HOXA7低表達(dá)或無(wú)表達(dá)的患者對(duì)化療藥物反應(yīng)好，提示HOXA7高表達(dá)在白血病MDR中發(fā)揮了重要作用。

有關(guān)HOXA7高表達(dá)導(dǎo)致白血病MDR的機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)外研究較少。許多化療藥物通過(guò)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡達(dá)到治療目的，而細(xì)胞周期相關(guān)基因p53等異常表達(dá)能通過(guò)改變細(xì)胞凋亡通路，拮抗外來(lái)信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，從而誘導(dǎo)耐藥，這種凋亡誘導(dǎo)的耐藥是白血病MDR的重要機(jī)制之一[5]。有研究表明，HOXA7能調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因p53的表達(dá)，提示HOXA7高表達(dá)可能通過(guò)抑制白血病細(xì)胞凋亡，從而誘導(dǎo)耐藥[6]。因此，抑制HOXA7高表達(dá)有望通過(guò)促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡，提高白血病對(duì)化療藥物的敏感性，最終逆轉(zhuǎn)MDR。但有關(guān)該方面的研究，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

目前，逆轉(zhuǎn)白血病MDR的方法主要有以下2類：（1）經(jīng)典的MDR逆轉(zhuǎn)劑，即針對(duì)MDR發(fā)生環(huán)節(jié)的特異性逆轉(zhuǎn)藥物，如鈣離子通道阻滯劑、鈣調(diào)蛋白抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、激素類化合物、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑等；（2）以生物治療劑作為逆轉(zhuǎn)劑，如某些細(xì)胞因子、單克隆抗體、核酶、中藥制劑、反義寡核苷酸和小干擾RNA為基礎(chǔ)的RNAi，其中RNAi沉默靶基因具有特異性高、操作簡(jiǎn)單、快速和無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)[7]，是目前國(guó)內(nèi)外最先進(jìn)的抑制靶基因表達(dá)的方法。因此，基于RNAi的新型逆轉(zhuǎn)白血病MDR的治療手段是目前白血病治療的熱點(diǎn)。Rumpold等[8]運(yùn)用RNAi技術(shù)抑制白血病MDR相關(guān)基因P-gp表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株恢復(fù)了對(duì)化療藥物甲磺酸伊馬替尼和多柔比星的敏感性。Zhou等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在多柔比星誘導(dǎo)的白血病MDR細(xì)胞株K562/A02和白血病患者中均存在sorcin高表達(dá)，靶向sorcin的小干擾RNA通過(guò)抑制sorcin表達(dá)，逆轉(zhuǎn)白血病MDR。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明，RNAi抑制HOXA9表達(dá)后能增強(qiáng)U937細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿和柔紅霉素的敏感性[10]，逆轉(zhuǎn)白血病MDR。以上研究結(jié)果表明，RNAi可通過(guò)抑制白血病MDR相關(guān)基因表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)白血病MDR。

本研究將前期構(gòu)建的靶向HOXA7基因的特異性真核表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至U937細(xì)胞，RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別鑒定該載體對(duì)HOXA7表達(dá)的抑制作用，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中HOXA7在mRNA和蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，表明穩(wěn)定表達(dá)pGPU6/GFP/NeoshHOXA7的U937細(xì)胞系構(gòu)建成功，該載體在mRNA和蛋白水平均能有效抑制HOXA7表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本研究運(yùn)用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)Ara-C和HHT的敏感性變化，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組RNAi抑制HOXA7表達(dá)后，細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性明顯提高，實(shí)驗(yàn)組Ara-C和HHT的IC50與對(duì)照組相比，分別降低了3.5倍和8.5倍，這說(shuō)明RNAi抑制HOXA7表達(dá)后能增強(qiáng)U937細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。Orlovsky等[11]在NOD/SCID小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，抑制HOXA7表達(dá)能阻礙白血病細(xì)胞在骨髓中的植入，并抑制白血病細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的增殖。本研究也發(fā)現(xiàn)，相同濃度的Ara-C和HHT作用時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率高于對(duì)照組，說(shuō)明RNAi抑制HOXA7表達(dá)能抑制白血病細(xì)胞增殖，這與Orlovsky等[11]的研究結(jié)論相同。本研究還運(yùn)用FCM法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示：未加化療藥物時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)一定程度的凋亡，加入化療藥物Ara-C或HHT后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞因RNAi抑制了HOXA7的表達(dá)，其凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，該結(jié)果說(shuō)明RNAi抑制HOXA7表達(dá)后能通過(guò)促進(jìn)U937凋亡或增強(qiáng)化療藥物對(duì)U937細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，逆轉(zhuǎn)U937細(xì)胞MDR。

綜上所述，HOXA7高表達(dá)與白血病MDR密切相關(guān)，本研究構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7的U937細(xì)胞能有效抑制HOXA7表達(dá)；在此基礎(chǔ)上，RNAi抑制HOXA7表達(dá)后能通過(guò)增強(qiáng)化療藥物Ara-C和HHT對(duì)U937細(xì)胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，在一定程度上逆轉(zhuǎn)白血病MDR。因此，提示RNAi抑制HOXA7表達(dá)有望成為逆轉(zhuǎn)白血病MDR的新方法。

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