陳 靜，祁東利，張春風(fēng)，陳 平，楊中林*

(1.中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009;2.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023)

脂肪性肝病包括酒精性脂肪肝病(AFLD)和非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver diseases，NAFLD)兩大類，其中，NAFLD在臨床上更為常見，是一種嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的常見隱匿性肝病。目前NAFLD的臨床治療藥物有胰島素增敏劑、減肥藥、調(diào)脂藥、降壓藥、抗氧化劑、細(xì)胞保護(hù)劑、抗炎細(xì)胞因子等類型。由于近年來NAFLD的發(fā)病率逐年升高，發(fā)病機(jī)制未完全清楚，藥物治療也不完善，因此尋找良好的預(yù)防和治療非酒精性脂肪肝病的藥物尤為迫切。

人參皂苷Rbl是人參和竹節(jié)參的代表成分之一，屬達(dá)瑪烷型三萜皂苷類化合物，具有多種生物活性，對心血管系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)都具有改善調(diào)節(jié)作用［1］，同時又具有抗腫瘤［2］，改善記憶力［3］，改善性功能［4］等功效，但尚未見人參皂苷 Rb1對非酒精性脂肪肝病的研究報道。本研究即模擬臨床上非酒精性脂肪肝病理特點(diǎn)，利用油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞形成具有明顯脂滴增加特征的脂質(zhì)堆積肝細(xì)胞模型，評價人參皂苷Rb1改善該細(xì)胞模型脂質(zhì)堆積作用及降低細(xì)胞內(nèi)TG含量作用，揭示其在防治脂肪肝方面的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2，中國藥科大學(xué)國家新藥篩選中心饋贈。

1.1.2 藥物與試劑

人參皂苷Rb1(中國藥品生物制品鑒定所，批號:110704－200921);高糖DMEM干粉培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號:991030);胎牛血清(FBS)(美國Hyclone公司，批號:NWC0388);胰蛋白酶(美國Gibco公司，批號:27250018);油酸(美國 sigma公司，批號:026K13971V);油紅O(美國Sigma公司，批號:O0625);牛血清白蛋白(BSA)(瑞士Roche公司，批號:738328);TG試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司，批號:006304);MTT(美國Amresco公司，批號:0793);Western及IP細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所);二甲基亞砜(DMSO)、異丙醇、乙醇(南京化學(xué)試劑有限公司，分析純)。

1.1.3 儀器

JJ－CJ－1FD型潔凈工作臺(蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司);XDS－1B型倒置光學(xué)顯微鏡(重慶光電有限公司);二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司);MH－1型細(xì)胞板振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);RT－6000型酶標(biāo)分析儀(深圳書社生命科學(xué)股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3天用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1∶3進(jìn)行傳代，取對數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 法測 HepG2 細(xì)胞活力

將HepG2接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞約1萬個，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，設(shè)對照組和終濃度為300、250、200、150、100、50、10、5、1 μg·mL－1人參皂苷 Rb1 加藥組，每組6個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加0.5 mg·mL－1MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，棄培養(yǎng)基，每孔加DMSO 150μL，在細(xì)胞振蕩器上振蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm處測吸光度。根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞存活率，選擇人參皂苷Rb1合適的給藥濃度范圍。

式中:A加藥490nm為加藥組吸光度;A對照490nm為對照組吸光度。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)TG檢測

蛋白吸附法配制油酸溶液［5］:70℃振蕩水浴下將油酸溶于 0.1 mmol·L－1NaOH 中，配成 100 mmol·L－1的儲存液;55℃振蕩水浴下將上述儲存液滴入10%BSA 的PBS 溶液中，配成濃度5 mmol·L－1的使用液，過濾除菌，－20℃冷凍保存，使用前55℃水浴15 min并冷卻至室溫。

將HepG2細(xì)胞接種于24孔板，孵育24 h后取出，設(shè)置對照組、模型組和不同濃度人參皂苷Rb1加藥組，每組均設(shè)6個平行孔。對照組加含2%BSA的1%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，模型組每孔加含終濃度1 mmol·L－1油酸的1%FBS高糖 DMEM 培養(yǎng)基，各加藥組加含終濃度1 mmol·L－1油酸和各濃度(5、10、25、50、75、100、150 μg·mL－1)人參皂苷 Rb1的1%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基。將24孔板置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后去除培養(yǎng)液，用PBS輕洗兩遍，再用Western及IP細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，6 000 r·min－1離心 5 min，取上清液，用TG試劑盒測定TG含量，并計(jì)算各加藥組對TG的清除率。

式中:A模型為模型組吸光度;A加藥為加藥組吸光度。

1.2.4 油紅O染色

油紅O工作液配制［6］:油紅O溶于異丙醇配成0.5%油紅O貯備液，以6∶4的比例將貯備液與蒸餾水混勻后過濾2次，至液體澄清為止，得油紅O工作液。

將HepG2細(xì)胞接種于24孔板，孵育24 h后取出，分為對照組、模型組、低中高濃度(10、50、100 μg·mL－1)人參皂苷Rb1加藥組，各組所加培養(yǎng)基同“1.2.3”項(xiàng)下所述。繼續(xù)孵育24 h后去除培養(yǎng)液，油紅O工作液對各組細(xì)胞染色30 min，蒸餾水洗兩次，在倒置顯微鏡下觀察染色效果。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

通過Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、作圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)表示，采用t檢驗(yàn)法比較組間差異，p＜0.05具有顯著性差異，p＜0.01具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rb1的細(xì)胞毒理學(xué)評價

高濃度的人參皂苷Rb1具有一定的細(xì)胞毒性，本實(shí)驗(yàn)通過MTT法檢測人參皂苷Rb1對HepG2細(xì)胞存活率的影響，選取對細(xì)胞毒害作用較小的人參皂苷Rb1濃度作為實(shí)驗(yàn)的加藥濃度。

表1 人參皂苷Rb1對HepG2細(xì)胞活力與存活率影響，n=6)

表1 人參皂苷Rb1對HepG2細(xì)胞活力與存活率影響，n=6)

組別 濃度(μg·mL－1) A490 nm 存活率對照組 －1.122 ± 0.039 100%1.129 ± 0.124 100.6%5 1.111 ±0.076 99.0%10 1.094 ± 0.047 97.5%50 1.073 ± 0.040 95.6%100 1.034 ± 0.027 92.2%150 1.013 ± 0.046 90.3%200 0.955 ±0.080 85.1%250 0.890 ± 0.045 79.3%1人參皂苷Rb1給藥組300 0.847 ± 0.052 75.5%

如表1所示，隨著人參皂苷Rb1濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，說明人參皂苷Rb1對HepG2細(xì)胞有一定的毒害作用。當(dāng)其濃度小于150μg·mL－1時，細(xì)胞存活率在90%以上，對細(xì)胞毒害作用很小，因此人參皂苷Rb1的給藥濃度可設(shè)定在1～150 μg·mL－1之間。

2.2 人參皂苷Rb1對HepG2細(xì)胞TG含量的影響

實(shí)驗(yàn)選取了對細(xì)胞毒害作用較小的人參皂苷Rb1系列濃度，測定該系列濃度下人參皂苷Rb1對HepG2細(xì)胞脂肪堆積模型TG含量的影響作用。

表2 人參皂苷Rb1對TG含量的影響n=6)

表2 人參皂苷Rb1對TG含量的影響n=6)

注:△△△P ＜0.001，與對照組比較;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001，與模型組比較

清除率對照組組別 濃度(μg·mL－1)1 000萬細(xì)胞TG含量(mg)TG 1.298 ±0.037 －模型組 － 6.630±0.036△△△ 100%－5人參皂苷Rb1給藥組30.8%6.878 ±0.029 －3.7%10 6.602 ±0.030 0.4%25 6.271 ±0.026 5.4%50 5.387 ±0.021* 18.7%75 5.055 ±0.029* 23.8%100 4.116 ±0.022＊＊＊ 37.9%150 4.586 ±0.029＊＊

圖1 人參皂苷Rb1對TG含量的影響

如表2和圖1所示，模型組與對照組相比，TG含量顯著增加，具有極顯著性差異(p＜0.001)，表明HepG2細(xì)胞脂肪堆積模型成功建立。150μg·mL－1和100 μg·mL－1人參皂苷 Rb1 組與模型組相比，TG含量具有極顯著性差異(p＜0.01);75μg·mL－1和 50 μg·mL－1人參皂苷 Rb1 組與模型組相比，TG含量具有顯著性差異(p＜0.05)，并且在5～100μg·mL－1濃度范圍內(nèi)隨人參皂苷Rb1濃度的升高，對細(xì)胞內(nèi)TG的清除率也逐漸升高，表現(xiàn)出較明顯的劑量依賴性，其中100μg·mL－1人參皂苷Rb1組降低細(xì)胞內(nèi)TG的作用最強(qiáng)，對TG的清除率達(dá)37.9%。

2.3 人參皂苷Rb1減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的作用

倒置顯微鏡對油紅O染色的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察(圖2)，結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞出現(xiàn)大量紅色脂滴，脂滴數(shù)量非常多，并發(fā)生相互融合現(xiàn)象，說明HepG2細(xì)胞脂肪堆積模型成功建立。隨著人參皂苷Rb1濃度的增加，HepG2細(xì)胞紅色脂滴數(shù)量呈現(xiàn)減少的趨勢，且脂滴變小，顏色變淺。低中高濃度人參皂苷 Rb1組中，低濃度組(10μg·mL－1)的效果差，與模型組差異不大;中濃度(50μg·mL－1)組改善細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積較明顯，相較于模型組，減輕了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)相互融合的現(xiàn)象;高濃度(100μg·mL－1)組可顯著減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積現(xiàn)象，脂滴數(shù)量明顯減少，顏色也明顯變淺。

通過人參皂苷Rb1對細(xì)胞內(nèi)TG含量影響和改善脂肪堆積現(xiàn)象可知，人參皂苷Rb1具有良好的體外降脂活性，提示其有一定的防治脂肪肝的作用。

圖2 各組細(xì)胞染色圖

3 討論

自1958年首次正式報道非酒精性脂肪肝病(NAFLD)至今，NAFLD已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)普遍存在并日趨嚴(yán)重的疾病，目前全球的平均發(fā)病率大約20%左右，并呈逐年增加趨勢。NAFLD是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致肝功能異常的主要原因，其典型特征是肝臟脂肪積聚。甘油三酯是NAFLD患者肝臟內(nèi)蓄積的主要脂質(zhì)，它的積聚是合成與轉(zhuǎn)化失衡的結(jié)果［7］。NAFLD的發(fā)病目前尚不能以單一的機(jī)制解釋，一般認(rèn)為它是一種遺傳－環(huán)境－代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病，人們廣泛接受的理論是Donati和Diehl等提出的“二次打擊”學(xué)說［8］。

目前國內(nèi)外對脂肪肝的研究主要采用動物模型，細(xì)胞模型研究較少。由于動物模型存在個體差異較大、實(shí)驗(yàn)條件不易控制、整體影響因素多、材料耗費(fèi)多、研究周期長且穩(wěn)定性較差等不利因素，因此成功建立穩(wěn)定的細(xì)胞模型可很好的克服上述缺點(diǎn)，并且能針對性地探究NAFLD發(fā)病的細(xì)胞機(jī)理。

HepG2細(xì)胞易于培養(yǎng)，細(xì)胞特性穩(wěn)定，并已成功用于脂肪肝細(xì)胞模型的建立，在細(xì)胞水平上篩選脂肪肝防治藥物或探討脂肪肝的病理機(jī)制。長鏈脂肪酸能使HepG2細(xì)胞形成明顯的脂滴，進(jìn)而引起HepG2細(xì)胞脂肪堆積。在游離脂肪酸中含量最高的是油酸，因此可選擇油酸誘導(dǎo)建立肝細(xì)胞脂肪堆積模型，它符合 NAFLD 形成的病理生理過程［9］。Yasuyuki等［10］用1 mmol·L－1的油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h后，成功建立肝細(xì)胞脂肪堆積模型;Cui等［11］采用油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24h，采用比色定量法研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積程度與油酸濃度(0.1－2 mmol·L－1)呈正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)MNAFLD的發(fā)病過程，選用油酸做造模劑，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h成功建立脂肪堆積模型，并選擇NAFLD的常規(guī)檢測指標(biāo)(TG含量、脂滴量)評價人參皂苷Rb1對細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，100μg·mL－1人參皂苷 Rb1組作用最顯著，其TG含量與模型組比較，具有極顯著性差異(p＜0.01)，對細(xì)胞內(nèi)TG的清除率達(dá)37.9%，并且人參皂苷Rb1在5～100μg·mL－1的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較明顯的劑量依賴性。因此人參皂苷Rb1具有良好的降脂作用，在脂肪肝防治方面具有潛在藥用價值，但目前人參皂苷Rb1的降脂機(jī)制還不十分明確，具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

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