宋 芹，陳封政，顏 軍，郭曉強(qiáng)，姚 倩，黃露萍，茍小軍

(成都大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610106)

膠原蛋白(Collagen)又稱膠原，是真皮的主要組成成分。由于膠原蛋白分子中含有大量的酰胺基團(tuán)和羥基，具有較強(qiáng)的吸濕性，使皮膚保持飽滿充盈［1-3］。隨著人們年齡的增長，真皮內(nèi)的膠原發(fā)生降解和老化，分子間會(huì)形成不規(guī)則的架橋，使皮膚的保濕能力減退，皮膚變得干燥而粗糙。目前，人們常通過補(bǔ)充膠原蛋白達(dá)到延緩衰老的美容保健效果，采用生物酶解技術(shù)，將其水解成分子量小，透皮吸收性能良好的膠原蛋白寡肽［4］，作為化妝品或功能性食品原料［5-6］。本實(shí)驗(yàn)將采用酶法從羅非魚魚鱗中提取獲得平均分子量小于1000u的膠原蛋白寡肽，分析其分子量分布，考察寡肽對人皮膚成纖維細(xì)胞增殖和透明質(zhì)酸分泌的影響;建立D-半乳糖衰老模型小鼠，考察膠原蛋白寡肽對小鼠真皮中膠原蛋白合成的影響，初步探討羅非魚膠原蛋白寡肽在皮膚美容保健方面的功效及作用機(jī)制，為化妝品與功能性食品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚干燥魚鱗 海南水產(chǎn)品市場;蛋白酶MG

日本天野エンザイム株式會(huì)社;復(fù)合蛋白酶HHM、膠原蛋白復(fù)合酶 日本高研株式會(huì)社主席研究員郁小兵博士提供;三氯乙酸，羥脯氨酸等試劑 均為分析純;人皮膚成纖維細(xì)胞 日本北海道大學(xué)齒科研究室;α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國 GIBCO公司;青鏈霉素雙抗 美國Invitrogen公司;細(xì)胞數(shù)測定試劑盒WST-8 kit キシダ化學(xué)株式會(huì)社;透明質(zhì)酸測定試劑盒 日本生化學(xué)工業(yè)社。昆明種小鼠(雄性)，體重25～30g 東京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

LC-9A shimaDZU/C-R7A高效液相色譜儀、UV-1601型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;METTLER-AE100型電子天平 瑞士METTLER公司;Infinite500全自動(dòng)酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠原蛋白寡肽(Collagen peptid，簡稱CP)制備取羅非魚魚鱗經(jīng)HCl脫鈣后，在45℃下，采用復(fù)合酶(1%MG+1%HHM)酶解12h，滅活后，冷凍干燥，得膠原蛋白寡肽，平均分子量約為920u，10個(gè)氨基酸以下的寡肽約占50%，三肽約占12%［4］。取CP適量，溶解于0.9%NaCl溶液中，制成5mg/mL溶液。

1.2.2 CP對人正常成纖維細(xì)胞增殖的影響

1.2.2.1 人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 人皮膚成纖維細(xì)胞于MEM培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)在5%CO2，濕度95%，恒溫37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取96孔板，按每孔1×103個(gè)播種細(xì)胞。待細(xì)胞附著后，各組中分別加入 15、30、60μg/mL CP 溶液 10μL，以加入相同體積PBS緩沖液作為空白對照組。

1.2.2.2 WST-8法測定細(xì)胞數(shù) 在添加CP溶液后培養(yǎng)細(xì)胞72h，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，向各孔中加入WST-8溶液10μL，重新放回CO2培養(yǎng)箱中孵育，進(jìn)行顯色反應(yīng)。4h后取出，在450nm下測定OD值。

1.2.3 CP對人正常成纖維細(xì)胞透明質(zhì)酸分泌的影響取96孔板，按每孔1×103個(gè)播種細(xì)胞，每3d換液一次。待細(xì)胞附著后，各組中分別加入100μg/mL CP溶液10μL，以加入相同體積PBS緩沖液作為空白對照組。培養(yǎng)7d后，按試劑盒說明書測定透明質(zhì)酸分泌量。

1.2.4 CP對小鼠皮膚膠原蛋白合成的影響 取健康雄性小鼠50只，隨機(jī)分為正常組、模型組、各CP給藥組(125、250、500mg/kg);正常組和模型組給予等體積的CMC-Na;給藥同時(shí)模型組和各給藥組皮下注射 5%D-半乳糖 0.25mL/10g［7］;正常組皮下注射等體積的生理鹽水;連續(xù)6周，最后1d灌胃和注射D-半乳糖2h后，處死，取小鼠背部皮膚，8%硫化鈉脫毛，用脫脂液(氯仿∶乙醇 =2∶1)脫脂24h，取出清洗后真空干燥，取少量放入試管中，各樣品加入6mol/L鹽酸水解，采用分光光度法［8-10］測定羥脯氨酸(HYP)含量，按膠原蛋白中14%的HYP換算小鼠皮膚中的膠原蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性

結(jié)果如表1所示，人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖活性明顯強(qiáng)于空白對照組，說明CP對體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖活性具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。

表1 CP對人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響WST-8(±s)Table 1 Effect of collagen oligopeptid on cell proliferation of human skin fibroblast WST-8(±s)

表1 CP對人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響WST-8(±s)Table 1 Effect of collagen oligopeptid on cell proliferation of human skin fibroblast WST-8(±s)

注:與空白對照組比較，“＊＊”表示有極顯著差異p＜0.01。

0.278±0.046 CP(15μg/mL) 4 0.762 ±0.065＊＊CP(30μg/mL) 4 0.643 ±0.0825＊＊CP(60μg/mL) 4 0.628±0.0955空白組(PBS)4＊＊

2.2 人皮膚成纖維細(xì)胞透明質(zhì)酸的分泌

結(jié)果見圖1所示，CP組透明質(zhì)酸分泌量明顯高于空白組，具有顯著性差異(p＜0.05)，說明CP對體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞透明質(zhì)酸的分泌有顯著的影響。

圖1 CP對人皮膚成纖維細(xì)胞透明質(zhì)酸分泌的影響Fig.1 Effect of collagen oligopeptid on hyaluronic acid secretion of human skin fibroblast

2.3 小鼠皮膚中膠原蛋白含量

羥脯氨酸是膠原蛋白的一種特有氨基酸，常以羥脯氨酸的含量換算膠原蛋白含量。通過0、12.5、25、50、100μg/mL五種不同濃度的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)氧化脫羧反應(yīng)生成吡咯，以對二甲氨基苯甲醛顯色，測定558nm處的吸光度，以濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得回歸方程為y=0.0141x+0.0041，r=0.999。結(jié)果表明，羥脯氨酸含量在0～100μg/mL之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

各樣品于110℃，24h經(jīng)HCl水解后，羥脯氨酸充分游離。冷卻至室溫后，在減壓條件下，70℃水浴加熱，蒸干樣品液體，充分除去HCl。往試管中加入5mL蒸餾水，使殘留在管壁上的樣品充分溶解，取其中溶液0.5mL，加蒸餾水稀釋至10mL，經(jīng)氧化脫羧反應(yīng)生成吡咯，以對二甲氨基苯甲醛顯色，測定558nm處的吸光度A值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算羥脯氨酸含量，并換算膠原蛋白含量，結(jié)果如表2。

表2 CP對小鼠皮膚中膠原蛋白合成的影響(±s)Table 2 Effect of collagen oligopeptid on typeⅠcollagen secretion of mouse skin(±s)

表2 CP對小鼠皮膚中膠原蛋白合成的影響(±s)Table 2 Effect of collagen oligopeptid on typeⅠcollagen secretion of mouse skin(±s)

注:“*”表示給藥組與模型組相比差異顯著，p＜0.05;“##”表示模型組與正常組比較差異極顯著，p＜0.01。

正常對照組(PBS)10 63.6±3.2模型組(PBS) 10 58.3±3.7##CP(125mg/kg) 10 69.8±2.9*CP(250mg/kg) 10 68.3±3.7*CP(500 mg/kg) 10 69.1±4.2*

由表2可知，模型組與正常組比較具有極顯著差異，說明D-半乳糖所致小鼠皮膚衰老模型表現(xiàn)出明顯的膠原蛋白流失。CP給藥組與模型組相比，具有顯著差異，說明CP能有效緩解應(yīng)衰老所致的皮膚膠原流失，促進(jìn)真皮中膠原蛋白的合成。

3 結(jié)論

膠原蛋白寡肽是通過生物酶解的方法將膠原蛋白小分子化，獲得平均分子量1000u以下的寡肽。由于分子量小，透皮性能好［4］，可用于衰老皮膚膠原蛋白的補(bǔ)充。膠原蛋白寡肽中含甘氨酸、丙氨酸、天門冬氨酸等［11］，能對真皮細(xì)胞起到營養(yǎng)、保濕的作用，因此具有皮膚美容保養(yǎng)的功效［12-13］。

透明質(zhì)酸是皮膚和其它組織中廣泛存在的天然生物分子，具有極好的保濕作用，能預(yù)防和修復(fù)皮膚損傷，潤滑組織，被認(rèn)為是理想的天然保濕因子［14-16］。本實(shí)驗(yàn)以人皮膚成纖維細(xì)胞為研究對象，考察膠原蛋白寡肽對體外培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞的增殖活性與透明質(zhì)酸分泌的影響。結(jié)果表明，羅非魚魚鱗膠原蛋白寡肽能有效促進(jìn)人成纖維細(xì)胞的增殖與透明質(zhì)酸的分泌，提示該寡肽有助于恢復(fù)衰老皮膚的保濕性能與彈性。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，口服膠原蛋白寡肽，能加速真皮中膠原蛋白的合成，說明羅非魚魚鱗膠原蛋白寡肽在開發(fā)具有增加皮膚彈性、保濕、抗衰老等特性的功能性食品和化妝品方面具有良好的應(yīng)用前景。

［1］劉瑋，張懷亮.皮膚科學(xué)與化妝品功效評價(jià)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:255，289.

［2］程艷，祁彥，王超，等.保濕化妝品功效評價(jià)與發(fā)展展望［J］.香料香精化妝品，2006，3(1):31-34.

［3］劉剛.安全與功能性—關(guān)于膠原蛋白的探討［J］.明膠科學(xué)與技術(shù)，2010，30(2):87-89.

［4］宋芹，陳封政，顏軍，等.一種膠原蛋白寡肽體外透皮吸收性能研究［J］.成都大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，30(1):8-10.

［5］郭兆鋒，劉愛青.水解膠原蛋白在保健食品和化妝品中的應(yīng)用進(jìn)展(二)［J］.中國生物美容，2010(1):58-62.

［6］張俊杰，曾慶孝.魚鱗的開發(fā)利用前景［J］.中國水產(chǎn)，2004(5):74.

［7］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1994:895-939.

［8］藍(lán)蔚青，王川，李燕.豬皮中羥脯氨酸的含量測定［J］.中國食物與營養(yǎng)，2006，10:39-41.

［9］郭恒斌，曾慶祝，閆磊.分光光度法測定魚皮中羥脯氨酸含量［J］.現(xiàn)代食品科技，2007，23(7):81-84.

［10］王信蘇，汪之和.草魚魚鱗膠原蛋白的提取［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，22(4):147-149.

［11］宋芹，董小萍，郁小兵.部分哺乳動(dòng)物和魚類膠原蛋白中氨基酸的組成和含量的比較［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，12(24):1239-1242.

［12］薛艷麗 .膠原蛋白與美容［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2006，1(9):84.

［13］林琳.魚皮膠原蛋白的制備及膠原蛋白多肽活性的研究［D］.青島:中國海洋大學(xué)，2006.

［14］張榮鑫，王傲雪，涂彩霞.透明質(zhì)酸在皮膚科的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國生物美容，2009，4:64-69.

［15］孫尚志，張青春，張輝.透明質(zhì)酸的功能和生產(chǎn)進(jìn)展［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(3):88-89.

［16］黃岳山，潘藝茗，薛靜.不同相對分子量透明質(zhì)酸功能及應(yīng)用的研究［J］.透析與人工器官，2010，21(4):22-25.