張 朝，李永生，*，高秀峰

（1.四川大學(xué)化工學(xué)院，四川成都610065；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都610041）

POD（Peroxidase，EC1.11.1.7）是一類以血紅素為輔基的氧化還原酶，主要催化H2O2或其他過(guò)氧化物與酚類、胺類物質(zhì)的反應(yīng)[1]，廣泛存在于各種動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi)[2]。POD早期常作為標(biāo)記物用于醫(yī)學(xué)診斷、酶聯(lián)免疫反應(yīng)[3]；近年來(lái)其應(yīng)用范圍擴(kuò)展到食品的保鮮、工業(yè)“三廢”的處理、有機(jī)物和高分子的合成、木質(zhì)素的降解、生物傳感器的制作、農(nóng)業(yè)廢棄物的處理等領(lǐng)域[4]；目前廣泛使用的POD（辣根POD、大豆POD）產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴，成為制約其應(yīng)用的主要因素。植物來(lái)源的POD有著原材料廉價(jià)易得、易于純化、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，研究人員已對(duì)辣根[5]、荔枝果皮[6]、大豆[7]、蓮藕[8]、茭白[9]、甘薯葉[10]等植物樣品的POD進(jìn)行了分離純化和性質(zhì)研究。但是，從植物中篩選出一種富含POD的樣品，以期在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中提高POD產(chǎn)量，迄今國(guó)內(nèi)尚未見該方面的報(bào)道。本研究擬利用RCFA法測(cè)定多種植物樣品中POD的含量，找到一種POD含量較高的植物樣品，并對(duì)其POD進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，為POD的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考和理論依據(jù)。同時(shí)，這也是首次關(guān)于沙田柚皮過(guò)氧化物酶（SPP）的研究和報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙田柚 購(gòu)于四川成都華聯(lián)超市；Sephadex G-200 Whatman公司；H2O2成都金山化工試劑廠，分析純；GA 中國(guó)上海佘山化工廠，化學(xué)純；硫酸銨 廣東汕頭市西隴化工廠，分析純；考馬斯亮藍(lán)G250 上?；瘜W(xué)試劑公司，分析純；牛血清蛋白 Sigma公司，優(yōu)級(jí)純；磷酸、無(wú)水乙醇 成都科龍化工有限公司，分析純；磷酸氫二鈉 重慶北培化學(xué)試劑廠，分析純；磷酸二氫鈉 天津市化學(xué)試劑六廠，分析純。

721型分光光度計(jì) 配有流通池（光程為10mm，內(nèi)徑1.5mm），上海第三分析儀器廠；蠕動(dòng)泵 東北電力學(xué)院儀器儀表廠；GL-150型微型恒溫控制器 蘇州江東精密儀器有限公司；AUW型電子天平、流通式紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津株式會(huì)社；pH計(jì) 日本東亞電波工業(yè)株式會(huì)社；XWT-S小型臺(tái)式記錄儀 上海自動(dòng)化儀表三廠；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法 蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford染色法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)[11]。

1.2.2 植物樣品及沙田柚皮粗酶液的制備 用于植物樣品POD活性測(cè)定的粗酶液均采用研磨法[12]制備，過(guò)程如下：稱取適量新鮮植物樣品，剪碎后放置于研缽中，加入樣品質(zhì)量20%的玻璃微珠及5mL 0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.6）研磨至糊狀，在4000r/min下離心45min，過(guò)濾后取上清液并定容至10mL。

用于純化的SPP粗酶液采用勻漿法[13]制備。操作如下：稱取適量新鮮沙田柚皮置于勻漿器中，按料液比1∶5的比例加入0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.6）；用勻漿器處理10min后，冷卻、抽濾，將濾液反復(fù)凍融后即得SPP粗酶液（Ⅰ）。

1.2.3 SPP的分離純化過(guò)程 取15mL粗酶液（Ⅰ），加固體硫酸銨分級(jí)沉淀[14]，收集飽和度為40%～100%內(nèi)的沉淀，沉淀溶于1.5mL 0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.6）中，得酶液（Ⅱ）。將酶液（Ⅱ）上樣于Sephadex G-200凝膠層析柱（1cm×20cm）[6]，上樣體積為1mL。用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.6）以流速1mL/min洗脫，洗脫液最后經(jīng)過(guò)流通式紫外-可見分光光度計(jì)，在280nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)蛋白含量變化，收集各蛋白峰對(duì)應(yīng)的洗脫液。測(cè)定各收集液的酶活性和蛋白濃度[15-16]，得到純化后的酶液（Ⅲ）。

1.2.4 RCFA法測(cè)定過(guò)程 以RCFA法[17-18]測(cè)定POD活性濃度，測(cè)定過(guò)程如下：在反應(yīng)池中加入0.50mL 0.50mmol/L H2O2與0.50mL 1.56mmol/L GA溶液，混勻后預(yù)熱至37℃[19]；使用0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.6）徹底沖洗流路至吸光度零值，RCFA系統(tǒng)中存留緩沖液為1.0mL；將系統(tǒng)的入口和出口插入反應(yīng)池后，開啟蠕動(dòng)泵，使混合液循環(huán)至吸光度達(dá)到穩(wěn)定；然后在反應(yīng)池中加入酶液20μL（由于V酶液/V混合液〈1%，加入酶液所導(dǎo)致的溶液稀釋可忽略）開始進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)混合液被泵連續(xù)不斷地抽進(jìn)檢測(cè)器進(jìn)行循環(huán)，由記錄儀得到一條產(chǎn)物吸光度值隨時(shí)間變化的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，根據(jù)動(dòng)力學(xué)曲線法計(jì)算酶活性濃度。酶活性的定義：在測(cè)定條件下，吸光度值每分鐘增加0.01所需要的酶量，定義為一個(gè)活力單位（U）。

1.3 鮮重比活力和比活力的計(jì)算

鮮重比活力為總酶活與所取樣品鮮重的比值，U/mg，見式（1）。

鮮重比活力=酶液總酶活/樣品鮮重 式（1）

比活力根據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定用每毫克蛋白所含的酶活力單位數(shù)表示，U/mg，見式（2）。

比活力=酶液總酶活/酶液總蛋含量 式（2）

2 結(jié)果與分析

2.1 植物樣品鮮重比活力的比較

實(shí)驗(yàn)共測(cè)定了15種植物樣品，見表1，它們的鮮重比活力為1.10×10-4～1.51×10-2U/mg。柚皮類的樣品鮮重比活力普遍較高，沙田柚皮（1.51×10-2U/mg）的鮮重比活力是紅薯（1.20×10-3U/mg，鮮重比活力僅次于柚皮類）的12.56倍。由此可見，沙田柚皮的POD含量極高，是一種制備POD的理想原材料。

表1 各種植物樣品中鮮重比活力Table 1 Specific activity with fresh weight of various plant samples

2.2 SPP的分離純化

洗脫曲線如圖1所示，洗脫過(guò)程中共出現(xiàn)四個(gè)蛋白峰，通過(guò)測(cè)定收集液的酶活性表明，SPP僅存在于第一個(gè)蛋白峰收集液（活性濃度為2925U/L），之后的三個(gè)蛋白峰收集液均無(wú)SPP酶活性（活性濃度為0）。純化結(jié)果見表2，鹽析過(guò)程的純化倍數(shù)為4.49倍，產(chǎn)率為73.93%；再經(jīng)Sephadex G-200凝膠柱層析，純化倍數(shù)達(dá)到26.22倍，產(chǎn)率為43.20%。經(jīng)過(guò)兩步純化，SPP的比活力從11.95U/mg提高至313.29U/mg。由此可見，該過(guò)程達(dá)到了純化SPP的目的，且產(chǎn)率良好。

表2 SPP純化效果評(píng)價(jià)Table 2 Effect of the purification of SPP

圖1 葡聚糖G-200柱層析結(jié)果Fig.1 Sephadex G-200 column gel filtration of SPP

2.3 SPP最適溫度及溫度穩(wěn)定性的考察

分別測(cè)定不同溫度（35～80℃）下酶液（Ⅲ）的活性。以最適溫度下的酶活性為100%，其余溫度下的酶活性分別與之相比得相對(duì)酶活性。圖2是不同溫度下的相對(duì)酶活性曲線，在溫度為55℃時(shí)達(dá)到峰值，表明SPP的最適溫度為55℃。在35～55℃時(shí)，相對(duì)酶活性隨著溫度的升高而升高，溫度對(duì)SPP的活性表現(xiàn)出促進(jìn)作用，這是由于溫度升高使底物活化分子增多，反應(yīng)速率加快；在55～80℃時(shí)，相對(duì)酶活性隨著溫度的升高而下降，溫度對(duì)SPP的活性體現(xiàn)抑制作用，是由于高溫使酶蛋白變性。

圖2 溫度對(duì)沙田柚皮過(guò)氧化物酶活性的影響Fig.2 Effect of temperature on SPP activity

將酶液（Ⅲ）在不同溫度（4～85℃）下保存1h[7]，迅速冷卻后分別測(cè)定其剩余酶活性。以4℃下酶活性為100%，其余溫度下的酶活性分別與之相比得剩余酶活性，見圖3。溫度大于55℃時(shí)，酶活性迅速下降；在4～55℃時(shí)，酶活性基本不變（剩余酶活性＞91.7%）；故SPP具有良好的熱穩(wěn)定性，溫度適用范圍廣。

2.4 SPP最適pH及pH穩(wěn)定性的考察

分別測(cè)定不同pH（4.5～10.0）下酶液（Ⅲ）的活性，以最適pH下的酶活性為100%，其余pH下的酶活性分別與之相比得相對(duì)酶活性，見圖4。從圖4中可以看出，pH為5.5時(shí)，曲線達(dá)到峰頂，表明SPP的最適pH為5.5。pH為4.5～5.5時(shí)，酶活性隨著pH的升高而升高，其原因是pH的改變影響了酶蛋白的解離狀態(tài)[20]，在此pH范圍內(nèi)，pH越大，SPP的解離狀態(tài)越具有催化效率。pH為5.5～10時(shí)，酶活性隨著pH升高而降低，這是因?yàn)閜H繼續(xù)升高，SPP的解離狀態(tài)朝著失去酶活性的方向變化。

圖4 pH對(duì)沙田柚皮過(guò)氧化物酶活性的影響Fig.4 Effect of pH values on SPP activity

圖5 pH對(duì)沙田柚皮過(guò)氧化物酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH values on the stability of SPP

將酶液（Ⅲ）在不同pH（2.0～12.0）的磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L）中4℃下保存24h[21]后，分別測(cè)定其剩余酶活性；以酶液在各pH條件下不經(jīng)保存直接測(cè)定得到的酶活性為100%，保存24h后的酶活性分別與之相比得相對(duì)酶活性。pH為2和12時(shí)，測(cè)得保存24h后的酶活性為0，故相對(duì)酶活性也為0；其余條件下的相對(duì)酶活性見圖5。從圖5中可以看出，pH為7.5～8.0時(shí)，SPP活性穩(wěn)定。pH為5和10時(shí)，剩余酶活性分別為49.4%和50.5%，僅損失一半活性，說(shuō)明SPP具有較廣的pH適用范圍，酸堿耐受性強(qiáng)。

2.5 SPP酶動(dòng)力學(xué)研究

在最適條件下，測(cè)定不同H2O2濃度（0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60mmol/L）下酶液（Ⅲ）的酶促反應(yīng)速率△A/△t，結(jié)果見圖6。從圖6中可以看出，當(dāng)H2O2濃度小于0.6mmol/L時(shí)，隨著H2O2濃度的增加，反應(yīng)速率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，這是由于底物濃度增加，導(dǎo)致反應(yīng)朝著生成產(chǎn)物的方向移動(dòng)，反應(yīng)速率加快；但隨著反應(yīng)體系中底物濃度越來(lái)越趨于飽和，底物濃度增加對(duì)反應(yīng)速率的影響也會(huì)逐漸減小。以H2O2濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速率的倒數(shù)△t/△A為縱坐標(biāo)，作Lineweaver-Burk圖[22]，見圖7，求得關(guān)于H2O2的雙倒數(shù)曲線的線性方程為y=0.1742x+1.7516（R=0.9985），由方程算得以H2O2為底物的Km與Vmax分別為0.099mmol/L、0.569mmol/（L·min）。

圖6 反應(yīng)速率與H2O2濃度關(guān)系曲線Fig.6 Relationship between reaction speed and H2O2concentration

圖7 以H2O2為底物的Lineweaver-Burk圖Fig.7 Lineweaver-Burk plots of SPP with H2O2

同樣，測(cè)定不同GA濃度（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75mmol/L）下酶液（Ⅲ）的酶促反應(yīng)速率△A/△t，結(jié)果見圖8。曲線的變化趨勢(shì)與圖6相似，造成這種趨勢(shì)的原因相同。同樣，以GA濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速率的倒數(shù)△t/△A為縱坐標(biāo)，作Lineweaver-Burk圖，見圖9，求得關(guān)于GA的雙倒數(shù)曲線的線性方程為y=1.1606x+1.344（R=0.9987），由方程算得以GA為底物的Km與Vmax分別為0.864mmol/L、0.744mmol/（L·min）。

圖8 反應(yīng)速率與GA濃度關(guān)系曲線Fig.8 Relationship between reaction speed and GA concentration

圖9 以GA為底物的Lineweaver-Burk圖Fig.9 Lineweaver-Burk plots of SPP with GA

3 結(jié)論

本研究從常見廢棄物沙田柚皮中找到了一種尚無(wú)研究報(bào)道的新型過(guò)氧化物酶——SPP，該酶具有含量豐富的顯著特點(diǎn)。同時(shí)，也填補(bǔ)了關(guān)于不同植物中過(guò)氧化物酶含量比較研究的空白。

對(duì)SPP的純化，并沒有像傳統(tǒng)的POD純化方法那樣經(jīng)過(guò)二次沉淀和二到三次層析，而是使用硫酸銨鹽析、Sephadex G-200凝膠柱層析兩步法即達(dá)到了純化目的；該純化方法操作簡(jiǎn)單，大大縮短了純化周期，既節(jié)約了時(shí)間也節(jié)約了成本，比較適合工業(yè)生產(chǎn)。

酶學(xué)性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPP具有很廣的溫度和pH適用范圍：最適溫度為55℃，55℃以下保存1h幾乎不失活；最適pH為5.5，在pH5～10的條件下保存24h僅損失一半活性。

總之，SPP具有含量豐富、易于純化、溫度和pH作用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)；沙田柚皮是一種常見的生活垃圾，利用其生產(chǎn)高附加值的POD綠色環(huán)保、價(jià)格低廉，符合綠色化學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)；因此本研究的應(yīng)用前景是非常樂(lè)觀的。

[1]Dunford H B，Stillman J S.On the function and mechanism of peroxidase[J].Coord Chem Rev，1976，19：187-251.

[2]Welinder K G.Superfamily of plant，fungal and bacterial peroxidases[J].Curr Opin Struct Biol，1992，2：388-393.

[3]Winer J A.A review of the status of the horseradish peroxidase method in neuroanatomy[J].Biobehav Rev，1977，1（1）：45-54.

[4]孫立水，高強(qiáng).過(guò)氧化物酶的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].化工技術(shù)與開發(fā)，2006，35（12）：13-16.

[5]范軍，李純，稽躍琴，等.辣根過(guò)氧化物酶的分離制備和純化[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，25（3）：313-316.

[6]宮欽嵚，田世平.荔枝果皮過(guò)氧化酶的純化與性質(zhì)研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2006，29（6）：891-896.

[7]徐芝勇，嚴(yán)群，強(qiáng)毅，等.大豆過(guò)氧化物酶純化及酶學(xué)特性研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2006，21（2）：82-83.

[8]瑞琦，張麗麗，郭小路，唐云明.蓮藕過(guò)氧化物酶的分離純化及性質(zhì)研究[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，29（12）：66-67.

[9]周濤，許時(shí)嬰，王璋，等.茭白中過(guò)氧化物酶的部分純化及其性質(zhì)的初步研究[J].食品工業(yè)科技，2005，26（7）：81-83.

[10]付偉麗，唐靚婷，王松，等.甘薯葉過(guò)氧化物酶的分離純化及其部分性質(zhì)研究[J].食品科學(xué)，2010，31（7）：223-227.

[11]Bradford M M.A rapid method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J].Anal Biochem，1976，72：248-254.

[12]曹建康，姜微波，趙玉梅.果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2007：101-103.

[13]何平，施偉平，傅雪琳，等.甘蔗苗過(guò)氧化物酶的分離、純化及性質(zhì)測(cè)定[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，21（2）：131-133.

[14]劉均洪，邱龍輝，李俊峰，等.豆殼過(guò)氧化物酶的分離純化新工藝研究[J].化學(xué)工程，2005，33（6）：32-34.

[15]曹穩(wěn)根，焦慶才，劉茜，等.考馬斯亮藍(lán)顯色劑變色反應(yīng)機(jī)理的研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2002，60（9）：1656-1661.

[16]Toyama H，Nishabayashi E，Saeki M，et al.Factors required for the catalytic reaction of PqqC/D which produces pyrroloquinoline quinine[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，354（1）：290-295.

[17]魏然飛，高秀峰，李永生.循環(huán)連續(xù)流動(dòng)分析法測(cè)定辣根過(guò)氧化物酶的活性[J].分析化學(xué)，2009，37（6）：897-901.

[18]王恒.測(cè)定過(guò)氧化物酶活性的循環(huán)催化流動(dòng)分析法的建立及多種植物實(shí)樣的測(cè)定研究[D].成都：四川大學(xué)，2010.

[19]張克堅(jiān)，楊振華.臨床酶學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化的新途徑[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1999，22（1）：54-55.

[20]Burnette F.Peroxidase and its relationship to food flavor and quality：A review[J].J Food Sci，1977，42：1-6.

[21]劉穩(wěn)，方靖，高培基.豆殼過(guò)氧化物酶的分離純化及其性質(zhì)研究[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，1998，14（5）：577-582.

[22]Cleland W W.The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products[J].Biochim Biophys Acta，1963，67：104-137.