魏 靜，王小冬

(1. 中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266100；2. 暨南大學(xué)赤潮與水環(huán)境研究中心，廣州 510632)

棕囊藻(Phaeocystis)引發(fā)的有害藻華遍布從熱帶到南北兩極的廣大海區(qū)，在海洋碳、氮和硫循環(huán)過程中具有重要的調(diào)控作用[1-2]．棕囊藻具有復(fù)雜的異型生活史[3]，其生長階段中包括微小的單細(xì)胞以及巨大的囊體階段，單細(xì)胞只有幾個微米，囊體直徑一般為幾百微米，中國南海和渤海發(fā)現(xiàn)的球形棕囊藻囊體直徑甚至達(dá)到 3,cm，是世界上發(fā)現(xiàn)的最大的球形棕囊藻[4-5]．棕囊藻藻華發(fā)生時多以囊體形態(tài)存在，單細(xì)胞偶爾存在[5]．囊體外被由一層輕薄、堅(jiān)韌而又具有彈性的半透膜組成，細(xì)胞分布于囊體外被內(nèi)表層，而內(nèi)部沒有細(xì)胞僅僅為一些液體，因此整個囊體為中空狀[6-7]．

由于棕囊藻囊體堅(jiān)韌的外被及相對較大的囊體體積，從而造成棕囊藻和攝食者之間的粒徑不匹配(size-mismatch)，導(dǎo)致浮游動物無法對囊體細(xì)胞進(jìn)行有效的攝食，從而顯著降低了囊體內(nèi)細(xì)胞的死亡率[8-11]．球形棕囊藻囊體形成和體積提高屬于誘導(dǎo)性防御，攝食者的加入可以顯著提高囊體體積[9]．即使不直接接觸浮游動物，棕囊藻囊體體積依然提高，可溶性化學(xué)信息在攝食-抑制攝食過程中具有重要的作用[10]．Long 等[11]2007 年發(fā)現(xiàn)球形棕囊藻能夠有效辨別攝食信息的性質(zhì)從而引發(fā)不同的生理響應(yīng)：當(dāng)中型浮游動物(＞200,μm)攝食時，囊體體積降低；當(dāng)微型浮游動物攝食(20～200,μm)時，囊體體積升高，從而降低了攝食的效率．

但是上述研究中采用的棕囊藻囊體體積均小于500,μm，而我國發(fā)現(xiàn)的球形棕囊藻囊體則能達(dá)到3,cm，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過中型浮游動物的粒徑范圍．微型浮游動物攝食提高囊體體積而中型浮游動物攝食引起囊體體積降低這一規(guī)律可能并不適應(yīng)我國海區(qū)球形棕囊藻．在本研究中，分別利用微型和中型攝食者攝食球形棕囊藻，觀察其囊體形成和體積變化，從而探索棕囊藻對浮游動物攝食的生理響應(yīng)．考慮到我國南海及其渤海海域頻發(fā)的球形棕囊藻藻華導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)災(zāi)難，本研究也可為球形棕囊藻藻華的防治提供一定的理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 藻種的培養(yǎng)

本研究中所用球形棕囊藻取自天津塘沽沿海藻華發(fā)生現(xiàn)場，囊體直徑范圍為 500,μm～1,cm，小心挑選健康完整的囊體用于實(shí)驗(yàn)．球形棕囊藻培養(yǎng)在鹽度為30,psu 的f/2 培養(yǎng)基中，溫度保持為20,℃，光照強(qiáng)度為100,μmol/(m2·s)，光暗比為 12,h∶12,h．每隔7,d 更換部分培養(yǎng)基，使棕囊藻保持在指數(shù)生長期.

本次研究中采用的攝食者分別為海洋彎曲甲藻(Oxyrrhis marina，OM)以及中華哲水蚤(Calanus sinicus，CS)．海洋彎曲甲藻購自美國西華盛頓大學(xué)Shannon Point 海洋中心，體長約 27,μm．海洋彎曲甲藻是攝食實(shí)驗(yàn)中反復(fù)使用的微型攝食者，能夠大量攝食球形棕囊藻[9]．而中華哲水蚤是我國海區(qū)主要的中型浮游動物，本次研究使用的中華哲水蚤采自廣東大亞灣，通過潛水Ⅱ型網(wǎng)進(jìn)行垂直拖網(wǎng)，樣品置于黑暗水體中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行挑取，選擇游動活躍的雌性中華哲水蚤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，中華哲水蚤體長約2.4,cm.

1.2 攝食者對棕囊藻的攝食

將海洋彎曲甲藻和中華哲水蚤分別培養(yǎng)于 1,L的平底燒瓶中(Duran group，German)，加入鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)進(jìn)行喂養(yǎng)(細(xì)胞密度為 4×103,/mL)．每天取 10,mL 培養(yǎng)液，通過 GF/F 膜過濾掉浮游植物和動物顆粒，保留過濾液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．同時在燒瓶中重新加入 10,mL 新鮮 f/2 培養(yǎng)液保持餌料生長旺盛．

將球形棕囊藻單細(xì)胞接種至15 個透明培養(yǎng)瓶中(BD Biosciences，USA)，接種體積為 500,mL，初始濃度為 4,000,個/mL．其中 5 個培養(yǎng)瓶每天加入 10,mL新鮮 f/2 培養(yǎng)液作為對照組，其余 10 個培養(yǎng)瓶分別加入上述濾出液作為攝食組(OM 組和 CS 組)．所有培養(yǎng)瓶每天均取出 10,mL 培養(yǎng)液，保持培養(yǎng)體積的恒定．所有培養(yǎng)瓶均置于搖床上(VWR Scientific，USA)晃動，搖床轉(zhuǎn)速為10,r/min，保持細(xì)胞均勻分布.培養(yǎng)溫度為 20,℃，光照強(qiáng)度為 100,μmol/(m2·s)，光暗比為12,h∶12,h．

1.3 取樣與測定

研究表明，相同條件下，球形棕囊藻在 4～12,d內(nèi)為指數(shù)生長期[12]．本次實(shí)驗(yàn)于第 8 天結(jié)束，每個培養(yǎng)瓶中取出 20,mL 培養(yǎng)液，加入終濃度為 4%的酸性Lugol′s 溶液固定．在 Nikon TS100 倒置顯微鏡下觀察計數(shù)囊體數(shù)量、囊體體積、囊體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量[12]．另取 2 份 20,mL 培養(yǎng)液，分別通過 20.0,μm 和 0.7,μm的濾膜，90%丙酮萃取24,h 后利用 TD-700 熒光計測定囊體細(xì)胞葉綠素含量以及總?cè)~綠素含量．最后將所有攝食者和餌料加入終濃度為 4%的酸性 Lugol′s溶液固定，計數(shù)攝食者和餌料的濃度．

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SigmaStat(v3.5,SPSS)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異性檢驗(yàn)．分析攝食組和對照組間球形棕囊藻囊體數(shù)量、囊體體積和囊體細(xì)胞數(shù)量的差異采用 One Way ANOVA，回歸線斜率差異性利用 One Way ANCOVA 檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)置為p＜0.05．

2 結(jié) 果

2.1 攝食信息產(chǎn)生

2 種攝食者均大量攝食了鹽生杜氏藻，其中海洋彎曲甲藻有效控制了杜氏藻的生長，并且自身密度提高了約5 倍(見表1)．盡管中華哲水蚤中餌料濃度依然很高，但是中華哲水蚤的密度在實(shí)驗(yàn)前后保持不變，且燒瓶底存在大量糞球，說明中華哲水蚤的攝食行為活躍．濾出液中存在可溶性攝食信息．

表1 實(shí)驗(yàn)前后攝食者和餌料濃度變化Tab.1 Changes in the grazer and prey concentration

2.2 球形棕囊藻囊體數(shù)量

無攝食壓力時，球形棕囊藻囊體數(shù)量為 433.3,個/mL(見圖 1)．當(dāng)存在攝食壓力時，無論是微型攝食者還是中型浮游動物，囊體數(shù)量均顯著提高(p=0.025)，分別達(dá)到 666.0,個/mL 和 702.8,個/mL，但是2 個攝食組間并未有顯著差異(p＝0.05)．

圖1 不同類型攝食壓力下囊體數(shù)量Fig.1 Colony amount under grazing pressure

2.3 球形棕囊藻囊體直徑

對照組中球形棕囊藻囊體直徑平均為2.5,mm(見圖 2)，而引入攝食信息后的囊體直徑分別達(dá)到 5.5,mm(OM 組)和 7.8,mm(CS 組)，均顯著高于對照組(p＜0.001)，且 CS 組囊體直徑顯著高于 OM組(p＜0.001)．說明中華哲水蚤產(chǎn)生的攝食信息導(dǎo)致球形棕囊藻囊體直徑進(jìn)一步提高．

圖2 不同攝食壓力下囊體直徑Fig.2 Colony diameters under grazing pressure

2.4 囊體葉綠素比例

未感受到攝食壓力脅迫時，球形棕囊藻囊體細(xì)胞葉綠素為總?cè)~綠素的 42.0%(見圖 3)．而一旦感受到攝食壓力，細(xì)胞更多的以囊體細(xì)胞形態(tài)存在，其比例顯著高于對照組(p＜0.001)，同囊體直徑相似，CS 組囊體直徑顯著高于OM 組(p＜0.001)．

圖3 不同攝食壓力下囊體細(xì)胞葉綠素百分?jǐn)?shù)Fig.3 Percentage of colonial chlorophyll a under grazing pressure

2.5 囊體細(xì)胞分布

將球形棕囊藻直徑和囊體細(xì)胞線性回歸，其斜率代表單位面積囊體細(xì)胞的密度．但是攝食壓力并未有效改變囊體細(xì)胞分布，2 個攝食組中單位面積細(xì)胞密度同對照組無顯著性差異(p＞0.05)，如圖 4所示．

圖4 不同攝食壓力下單位囊體面積的細(xì)胞豐度Fig.4 Cell concentration per unit colony surface under grazing pressure

3 討 論

由于培養(yǎng)體系中每天更新 f/2 培養(yǎng)液，因此濾出液添加至實(shí)驗(yàn)組中并不會導(dǎo)致營養(yǎng)鹽限制．盡管哲水蚤可能排泄氨氮[9]，但是棕囊藻囊體的形成更加依賴于硝酸鹽，因此濾出液中營養(yǎng)鹽濃度和結(jié)構(gòu)的微量變化并非導(dǎo)致棕囊藻囊體結(jié)構(gòu)變化的主因[9]，而攝食化學(xué)信息才是囊體形態(tài)變化的關(guān)鍵因素．浮游動物攝食和浮游植物抵御攝食過程并不需要兩者的直接接觸，浮游動物通過釋放攝食波可在較遠(yuǎn)距離感受浮游植物細(xì)胞的存在，而浮游植物也可通過物理感受器感受浮游動物的運(yùn)動或者化學(xué)感受器捕捉可溶性化學(xué)信息，從而做出逃逸、抵制和抗拒等行為[9，13]．本次研究中，浮游動物的培養(yǎng)濾出液即引發(fā)了球形棕囊藻的生理抵抗行為，說明球形棕囊藻對于此類化學(xué)信息感覺敏銳．

研究結(jié)果表明：微型攝食者的攝食信息提高了囊體直徑，中型浮游動物的攝食則導(dǎo)致棕囊藻囊體體積繼續(xù)增大．Long 等[11]利用湯氏紡錘水蚤(Acartia tonsa)對球形棕囊藻CCMP 627 進(jìn)行攝食，發(fā)現(xiàn)囊體比例和體積均下降．他們認(rèn)為中型浮游動物優(yōu)先選擇攝食囊體，球形棕囊藻的生活史由囊體向單細(xì)胞轉(zhuǎn)化有效降低了攝食死亡率．而 Tang[11]利用湯氏紡錘水蚤攝食球形棕囊藻 CCMP 1528，囊體體積和比例均提高，同本文的研究結(jié)果相同，同 Long 等[12]的結(jié)果相反．球形棕囊藻株系差異可能導(dǎo)致上述研究結(jié)果的不同．球形棕囊藻 CCMP 627 常常失去囊體的能力，即使形成囊體，其體積也在 500,μm 之下．而CCMP 1528 和本次研究采用的棕囊藻株系則始終保留著形成囊體的能力，且囊體直徑經(jīng)常達(dá)到 1,cm 以上．從而使得球形棕囊藻在面臨中型浮游動物的攝食信息時具有提高囊體直徑的空間．

球形棕囊藻囊體的形成和直徑提高導(dǎo)致了攝食者和食物顆粒間的粒徑不匹配，抑制了攝食者的攝食效率，保護(hù)了棕囊藻囊體細(xì)胞[13]．當(dāng)面臨攝食壓力時，球形棕囊藻能夠迅速提高囊體的數(shù)量，并且提高囊體的體積以抵制攝食[9]．本次研究結(jié)果同樣清楚說明了球形棕囊藻的這一生理特點(diǎn)．當(dāng)感受到攝食信息時，囊體的數(shù)量提高了約 50%，囊體直徑甚至提高了約 3 倍，接近中華哲水蚤體長．球形棕囊藻的單細(xì)胞更多以囊體細(xì)胞的形態(tài)存在，其比例從40%提高到60%～80%．由于中華哲水蚤攝食范圍在其體長的1/10～1/100 內(nèi)[14]，因此巨型囊體無法被中華哲水蚤攝食，而細(xì)胞直徑只有 27,μm 的海洋彎曲甲藻更無法攝食囊體，從而同樣降低了微型和中型攝食者的攝食壓力．

盡管攝食壓力有效提高了囊體的數(shù)量和體積，但是并未改變囊體的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞分布．即使攝食信息出現(xiàn)導(dǎo)致囊體體積快速的提高，囊體的細(xì)胞分布依然保持恒定，單位面積的細(xì)胞含量并未隨囊體的提高而降低，囊體體積和細(xì)胞數(shù)量回歸斜率的值保持 1.46左右，同歷史研究的結(jié)果具有很強(qiáng)的可比性[9，12]．球形棕囊藻囊體外被由一層致密堅(jiān)韌的黏多糖組成[6]，囊體形成需要占用細(xì)胞產(chǎn)生總碳量的 30%～40%，從而保持整個囊體結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度的穩(wěn)定[7]，因此囊體內(nèi)細(xì)胞分布在一般條件不會有大幅度變化．只有當(dāng)溫度、營養(yǎng)鹽或者光照等限制因素發(fā)生劇烈變化時，囊體細(xì)胞分布才會發(fā)生顯著變化．當(dāng)球形棕囊藻和南極棕囊藻(P. antarctica)的培養(yǎng)溫度提高 4,℃時，單位面積的囊體細(xì)胞密度顯著提高，使得棕囊藻囊體包含更多的細(xì)胞[12]．相對于硝酸鹽，銨鹽和尿素為氮源時也顯著降低了單位面積的囊體細(xì)胞數(shù)量[15]．相對于上述物理或者化學(xué)因素，攝食等生物因素對于囊體結(jié)構(gòu)的影響不顯著．棕囊藻對攝食壓力的響應(yīng)可能屬于長期進(jìn)化過程中特點(diǎn)，保守型較強(qiáng)，因此在囊體提高過程中不需要耗費(fèi)過多的能量，也不需要改變囊體結(jié)構(gòu)，不僅保持了囊體的穩(wěn)定性，而且有效降低了攝食死亡率．

浮游動物攝食和浮游植物抵御攝食過程并不需要兩者的直接接觸，浮游植物可以通過感受浮游動物釋放的可溶性化學(xué)信息做出逃逸、抵制和抗拒等行為．本次研究中，浮游動物的培養(yǎng)濾出液即引發(fā)了球形棕囊藻的生理抵抗行為，說明球形棕囊藻對于此類化學(xué)信息感覺敏銳．同其他浮游植物不同，球形棕囊藻通過生活史轉(zhuǎn)化將自身粒徑從μm 提高到 cm，跨越了 7 個數(shù)量級，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了微型浮游動物的粒徑，甚至超過了中華哲水蚤的攝食粒徑范圍，導(dǎo)致幾乎所有的浮游動物無法攝食，這可能解釋了棕囊藻藻華發(fā)生現(xiàn)場浮游動物數(shù)量極低的原因．盡管 Long 等[11]認(rèn)為球形棕囊藻根據(jù)攝食者的粒徑可以調(diào)整囊體的體積，導(dǎo)致兩者粒徑的不匹配．但是比較而言巨大囊體能夠抵御攝食者的范圍更廣，生態(tài)優(yōu)勢更加明顯．再加上囊體外被嚴(yán)謹(jǐn)致密的結(jié)構(gòu)，抑制了海洋細(xì)菌和病毒的感染，球形棕囊藻顯著降低了死亡率．因此，囊體形成和生活史轉(zhuǎn)化賦予了球形棕囊藻較優(yōu)越的競爭優(yōu)勢，能夠形成巨型囊體使我國球形棕囊藻的優(yōu)勢尤其顯著，有助于其頻繁導(dǎo)致大規(guī)模的藻華．

4 結(jié) 語

球形棕囊藻囊體形成是抵御浮游動物攝食的有效策略．球形棕囊藻能感受浮游動物釋放的攝食化學(xué)信息，其有效地改變了棕囊藻的生活史轉(zhuǎn)變過程．盡管有研究證明橈足類等中型浮游動物能夠降低球形棕囊藻的囊體形成率和囊體體積，但是本文的研究證實(shí)：海洋彎曲甲藻等微型攝食者提高了球形棕囊藻的囊體數(shù)量和囊體直徑，而中華哲水蚤釋放的攝食信息誘導(dǎo)球形棕囊藻囊體直徑持續(xù)提高，超過了中型浮游動物的攝食范圍，從而有效降低了攝食死亡率．球形棕囊藻頻繁形成大規(guī)模藻華的原因可能歸因于其生活史轉(zhuǎn)化和囊體形成所賦予的競爭優(yōu)勢．

［1］Lancelot C，Keller M D，Rousseau V，et al. Autoecology of the marine HaptophytePhaeocystis sp[J].Physiological Ecology of Harmful Algal Blooms，NATO ASI Series G：Ecological Sciences，1998，41：209-224.

［2］Schoemann V，Becquevort S，Stefels J，et al.Phaeocystisblooms in the global ocean and their controlling mechanisms：A review[J].Journal of Sea Research，2005，53(1/2)：43-66.

［3］齊雨藻，沈萍萍，王 艷. 棕囊藻屬(Phaeocystis)的分類與生活史(綜述)[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2001，9(2)：174-184.Qi Yuzao，Shen Pingping，Wang Yan. Taxonomy and lifecycle of genusPhaeocystis(Prymnesiphyceae)[J].Journal of Tropical and Subtropical Botany，2001，9(2)：174-184(in Chinese).

［4］Chen Yueqin，Wang Ning，Zhang Peng，et al. Molecular evidence identifies bloom-formingPhaeocystis(Prymnesiophyta)from coastal waters of southeast China asPhaeocystis globosa[J].Biochemical Systematics and Ecology，2002，30(1)：15-22.

［5］Rousseau V，Chréstiennot-Dinet M J，Jacobsen A，et al. The life cycle ofPhaeocystis：State of knowledge and presumptive role in ecology[J].Biogeochemical，2007，83(1/2/3)：29-47.

［6］Van Rijssel M，Hamm C，Gieskes W W C.Phaeocystis globosa(Prymnesiophyceae) colonies ： Hollow structures built with small amounts of polysaccharides[J].European Journal of Phycology，1997，32(2)：185-192.

［7］Hamm C E，Simson D A，Merkel R，et al. Colonies ofPhaeocystis globosaare protected by a thin but tough skin[J].Marine Ecology Progress Series，1999，187：101-111.

［8］Brussaard C P D，Kuipers B，Veldhuise M J W. A mesocosm study ofPhaeocystis globosapopulation dynamics：I. Regulatory role of viruses in bloom control[J].Harmful Algae，2005，4(5)：859-874.

［9］Jakobsen H H，Tang K W. Effects of protozoan grazing on colony formation inPhaeocystis globosa(Prymnesiophyceae)and the potential costs and benefits[J].Aquatic Microbial Ecology，2002，27(3)：261-273.

［10］Tang K W. Grazing and colony size development inPhaeocystis globosa(Prymnesiophyceae)：The role of a chemical signal[J].Journal of Plankton Research，2003，25(7)：831-842.

［11］Long J D，Smalley G W，Barsby T，et al. Chemical cues induce consumer-specific defenses in a bloomforming marine phytoplankton [J].Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America，2007，104(25)：10512-10517.

［12］Wang Xiaodong，Tang K W，Wang Yan，et al. Temperature effects on growth，colony development and carbon partitioning in threePhaeocystisspecies [J].Aquatic Biology，2010，9(3)：239-249.

［13］Nejstgaard J C，Tang K W，Steinke M，et al. Zooplankton grazing onPhaeocystis：A quantitative review and future challenges [J].Biogeochemistry，2007，83(1/2/3)：147-172.

［14］王小冬，孫 軍，劉東艷，等. 海洋中型浮游動物的選擇性攝食對浮游植物群落的控制[J]. 海洋科學(xué)進(jìn)展，2005，23(4)：524-535.Wang Xiaodong，Sun Jun，Liu Dongyan，et al. Control of phytoplankton community by marine mesozooplankton selective grazing [J].Advances in Marine Science，2005，23(4)：524-535(in Chinese).

［15］Wang Xiaodong，Wang Yan，Smith W O Jr. The role of nitrogen on the growth and colony development ofPhaeocystis globosa(Prymnesiophyceae) [J].European Journal of Phycology，2011，46(3)：305-314.