黃磊

【摘 要】以釀酒酵母YS5為出發(fā)菌株，經(jīng)蝸牛酶酶解獲得原生質(zhì)體后，用紫外線進(jìn)行誘變處理，通過一級篩選得到了61株誘變菌株，將這些誘變株直接進(jìn)行發(fā)酵，利用氣相色譜對發(fā)酵液酒精產(chǎn)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，經(jīng)過紫外線照射30s后，通過篩選獲得了一株酒精發(fā)酵較高產(chǎn)菌株，酒精產(chǎn)率達(dá)到了10.36%（v/v），比出發(fā)菌株提高了3.6%。

【關(guān)鍵詞】釀酒酵母；原生質(zhì)體；紫外誘變；甘蔗汁發(fā)酵

酵母細(xì)胞的融合及酵母原生質(zhì)體的誘變的一個(gè)重要前提就是如何制備大量的原生質(zhì)體，原生質(zhì)體制備率受到各種條件的影響，如菌齡、酶濃度、溫度、預(yù)處理等的影響，因此確定不同因素對酵母原生質(zhì)體的影響及優(yōu)化不同因素，可以大大提高產(chǎn)率。

1.菌體菌齡對原生質(zhì)體制備的影響

微生物的生理狀態(tài)是決定原生質(zhì)體產(chǎn)量的主要因素之一，特別是菌齡，明顯影響原生質(zhì)體釋放的頻率。不同時(shí)期的菌體，對各種溶壁酶的敏感性不同，原生質(zhì)體的形成率與再生率也有很大差異。

較年輕的菌體細(xì)胞制備原生質(zhì)體較為容易，而且此階段的原生質(zhì)體再生率也較高。處于對數(shù)生長期的菌體代謝活性高而穩(wěn)定、細(xì)胞壁對酶的作用較為敏感，且大小比較一致，生長適應(yīng)能力強(qiáng)，故通常取處于對數(shù)生長期的菌體制備原生質(zhì)體。有研究表明對數(shù)生長早期形成率最高，對數(shù)生長中期時(shí)再生率最高，對數(shù)生長晚期的再生率也比對數(shù)生長中期的低。這是由于細(xì)胞壁越稚嫩，越易被酶破壞，對數(shù)生長早期菌體幼小，代謝活性高而穩(wěn)定、細(xì)胞壁對酶的作用較為敏感，且大小比較一致，故生活適應(yīng)能力強(qiáng)；對數(shù)生長中期幼小菌體對不利因素抵抗能力差，一旦失去細(xì)胞壁，較難恢復(fù)；對數(shù)生長晚期的原生質(zhì)體存在著很大比例的非活性個(gè)體。菌體如果進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定和老化，不易去壁形成原生質(zhì)體，原生質(zhì)體形成率顯著降低，而且再生率也有所下降。

微生物的菌齡是隨著菌種和培養(yǎng)條件而異，酵母菌菌液中加入β-巰基乙醇可以破壞細(xì)胞壁組分中的二巰基，處于對數(shù)生長期的酵母菌菌體代謝極為旺盛，細(xì)胞壁易被瓦解，其細(xì)胞壁對蝸牛酶較為敏感，易于酶解脫壁，且酵母菌制備原生質(zhì)體時(shí)，要使菌體同步化才能大幅度的提高制備率。

2.穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體制備的影響

原生質(zhì)體由于剝除了細(xì)胞壁，失去其特有的保護(hù)作用，細(xì)胞對外界環(huán)境變的十分敏感，尤其對滲透壓。如果把它懸浮在蒸餾水或等滲溶液中，會(huì)吸水膨脹并破裂，所以必須在一定濃度的高滲溶液中進(jìn)行酶解、破壁、才能形成和保持穩(wěn)定的原生質(zhì)體。

作為穩(wěn)定劑的有無機(jī)鹽和有機(jī)物，無機(jī)鹽穩(wěn)定劑包括NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2等；有機(jī)物中有糖和糖醇，如蔗糖、甘露醇、山梨醇等。無機(jī)鹽利于原生質(zhì)體制備，糖類更適于其再生，可能糖溶液黏度大，不利于酶和細(xì)胞的分散與作用，而鹽對細(xì)胞壁降解有促進(jìn)作用，故能提高制備率卻不利于再生。酵母菌原生質(zhì)體制備和再生時(shí)的穩(wěn)定劑可選用無機(jī)鹽或糖醇類化合物，無機(jī)鹽類在促進(jìn)原生質(zhì)體再生方面不及糖和糖醇。其原因是：糖及糖醇是大分子物質(zhì)，阻礙酶與細(xì)胞壁充分接觸或者防礙原生質(zhì)體釋放，同時(shí)，其對原生質(zhì)體又有保護(hù)作用。

各種穩(wěn)定劑的pH值應(yīng)保持在一定范圍之內(nèi)，這需要適宜的緩沖液配合使用，以保證酶活性和菌體本身活性維持在一個(gè)叫高的水平。穩(wěn)定劑是一種高滲溶液，但是濃度也不能過高，否則會(huì)使原生質(zhì)體皺縮，一般在0.3-1.0mol/L之間。

概言之，穩(wěn)定劑的作用，不僅能防止原生質(zhì)體的破裂，控制并達(dá)到最大的數(shù)量，而且對提高酶的活性，促進(jìn)酶和底物的結(jié)合都具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)越性。不同的穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體的釋放和保護(hù)作用是不同的，一般認(rèn)為易于滲入質(zhì)膜和易于被原生質(zhì)體及菌體分解的物質(zhì)不宜作為穩(wěn)定劑。

3.酶解前的預(yù)處理對原生質(zhì)體制備的影響

用酶類來水解細(xì)胞壁，首先要使得酶溶液滲透到細(xì)胞壁中，但是生物體都具有保護(hù)自身的一套嚴(yán)密的結(jié)構(gòu)，不是任何物質(zhì)都可以隨意進(jìn)入的。為此，在用酶類處理之前，最好根據(jù)細(xì)胞壁的不同結(jié)構(gòu)和組成加入某些物質(zhì)先行預(yù)處理，以抑制或阻止某一種細(xì)胞壁成分的合成，從而使酶易于滲入，提高酶對細(xì)胞壁的酶解效果。

適當(dāng)預(yù)處理可在一定程度上破壞酵母菌細(xì)胞壁外層大分子高級結(jié)構(gòu)，改善通透能力，促進(jìn)細(xì)胞壁水解酶向內(nèi)壁層擴(kuò)散，提高原生質(zhì)體制備效率，并縮短酶作用時(shí)間，降低酶液對形成的原生質(zhì)體損傷，保持高活性，提高再生率和融合率。其作用主要是這些化合物能還原細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)的二硫鍵后，使分子鏈切開，酶分子易于滲入，促進(jìn)細(xì)胞壁的水解，易于釋放原生質(zhì)體。

SH-化合物（如β-巰基乙醇）廣泛運(yùn)用于酵母菌中，效果很好?？墒牵湍讣?xì)胞脫壁前，做一些預(yù)處理可使原生質(zhì)化率大大提高，但原生質(zhì)體再生率會(huì)有所降低，這是因?yàn)槠渥饔糜谀さ鞍祝斐杉?xì)胞損傷。酵母菌細(xì)胞壁外層由一蛋白鞘構(gòu)成，預(yù)處理劑EDTA 或 EDTA加巰基乙醇能破壞這一結(jié)構(gòu)，利于水解酶滲透進(jìn)入內(nèi)壁層并促進(jìn)其對細(xì)胞壁的降解，因此適度預(yù)處理后能顯著提高原生質(zhì)體制備率；用EDTA處理細(xì)胞，一方面將細(xì)胞壁中部分不溶性蛋白質(zhì)抽提出來，另一方面又通過EDTA與多種金屬離子形成絡(luò)合物，避免金屬離子對酶的抑制作用而提高酶的脫壁效果；用巰基乙醇處理對數(shù)期的細(xì)胞，以促進(jìn)蛋白質(zhì)中的二硫鍵斷裂，松動(dòng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使菌體的細(xì)胞壁對酶的敏感性增加，同時(shí)抑制細(xì)胞壁的重新合成。至于經(jīng)預(yù)處理后原生質(zhì)體再生率略低于非處理，但從形成率和再生率雙重因素考慮， 使用預(yù)處理再生總數(shù)高于非預(yù)處理。

4.酶系和酶的濃度對原生質(zhì)體制備的影響

各種微生物由于細(xì)胞壁組成不同用于水解細(xì)胞壁的酶的種類也不同。而酵母菌的細(xì)胞壁組成主要為葡萄糖和幾丁質(zhì)。用于水解的酶類主要有蝸牛酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶等。最常用的是蝸牛酶，它是一種以纖維素酶為主的混合酶，適合水解酵母細(xì)胞壁中的多種組分。

制備釀酒酵母原生質(zhì)體時(shí)，一般采用50μl EDTA和5μl巰基乙醇及1%纖維素酶高滲磷酸—甘露醇緩沖液預(yù)處理，原生質(zhì)體的獲得率達(dá)99%。但在蝸牛酶中復(fù)合加入纖維素酶能得到更理想的效果，加快細(xì)胞壁水解進(jìn)程，縮短處理時(shí)間，增強(qiáng)所得原生質(zhì)體活性，并提高再生率。

不同的微生物在制備原生質(zhì)體時(shí)所需酶的種類和酶量均不同，適宜的酶濃度是影響原生質(zhì)體形成與再生的重要因素，因?yàn)槊钢型袑υ|(zhì)體有害的酶類（如過氧化物酶、核糖核酸酶等），隨著酶量的增加，雜酶的濃度也會(huì)隨之增加，當(dāng)達(dá)到一定程度時(shí)，必然會(huì)影響原生質(zhì)體的活性，降低原生質(zhì)體的再生率。

總之用于水解細(xì)胞壁的酶濃度要適當(dāng)，酶量過低，作用不徹底，不利于原生質(zhì)體形成，濃度過高，處理時(shí)間過長，會(huì)影響原生質(zhì)體的數(shù)量和活性，致使再生率下降。

5.酶的作用溫度、時(shí)間和作用pH值

同樣的培養(yǎng)時(shí)間，不同的溫度下生長的細(xì)胞，其生理狀況是有差異的，會(huì)影響到原生質(zhì)體的形成。如酶解溫度過高或過低，都會(huì)影響酶的活性，使原生質(zhì)體形成率下降。不同的酶具有各自不同的最適溫度，這在水解細(xì)胞壁的時(shí)候是要首先考慮的。還要注意菌株生長的最適溫度，以避免因溫度不當(dāng)而導(dǎo)致原生質(zhì)體的活性降低，甚至破壞。確定酶解溫度的時(shí)候以上兩者均要兼顧?？偟恼f來，酵母菌的溫度要低些，多在38-30℃。

隨著時(shí)間的增加，原生質(zhì)體的形成率增加，可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，細(xì)胞壁的水解更為充分的原因。酶解時(shí)的最適pH值也隨著酶的特性和菌種的特性而異。

6.總結(jié)

可見，影響原生質(zhì)體制備和再生的因素很多，不同酶系統(tǒng)及酶濃度、滲透壓穩(wěn)定劑、酶解溫度、時(shí)間、不同前處理方法都有較大的影響，選擇合適的條件，以期大幅度提高原生質(zhì)體的形成率，從而為原生質(zhì)體的誘變育種及融合實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造更為充分的條件。