過七根

(九江學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 江西九江 332000)

腦膠質(zhì)瘤(Gliolma)是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，起源于腦組織中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，約占成人顱內(nèi)腫瘤的35.2～61%，其中惡性膠質(zhì)瘤約占43.6%[1]。腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率和惡性程度都很高，且常規(guī)的手術(shù)治療和化療、放療相結(jié)合的方法都難以徹底治愈。近年來隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，利用基因治療膠質(zhì)瘤的研究已成為必然趨勢(shì)和發(fā)展方向，目前應(yīng)用最多的包括抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)控子以及生長(zhǎng)因子等[1]。

Stat3蛋白異常激活與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前已有學(xué)者以Stat3為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤治療研究，取得了初步結(jié)果，但有關(guān)Stat3的詳細(xì)作用機(jī)制尚未明確，有待于進(jìn)一步深入研究。本試驗(yàn)采用RNAi的方法，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Stat3的低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，表明Stat3蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞正常生長(zhǎng)中起到重要作用，抑制該蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這將為體內(nèi)研究Stat3對(duì)膠質(zhì)瘤的作用及作用機(jī)制，并為腦膠質(zhì)瘤這一顱內(nèi)惡性腫瘤的基因治療提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人腦惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44，購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2 主要試劑

DMEM (Gibco)，F(xiàn)BS (Gibco)，SilenCircleTMRNAi Transcription Kit(美國(guó)綠陽生物技術(shù)公司)，LipofectamineTM2000 (Invitrogen)，Stat3多克隆抗體(Santa Cruz)，二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(Santa Cruz)。

1.3膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44的培養(yǎng)和免疫組織化學(xué)鑒定

細(xì)胞用含10% FBS的DMEM于37℃、50 mL/L CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，2～3d傳代一次。染色前1d將細(xì)胞種植到0.1(W/V)Poly-L-Lysine包被的玻片上，染色當(dāng)天取出待染細(xì)胞，用PBS液洗去殘余培養(yǎng)液，4%(m/m)多聚甲醛固定20min[1]。PBS液洗2次，每隔10min 1次；10 %(v/v)正常山羊血清封閉1h；PBS液洗3次；Stat3多克隆抗體(1∶300的體積比，用0.1 mM PBS稀釋)4℃過夜，PBS液洗3次；加二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶100的體積比，用0.1mM PBS稀釋)32℃孵育1 h，PBS液洗3次；加液體AEC酶顯色，常光下觀察。

1.4 shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)Stat3基因的全長(zhǎng)序列，按照SilenCircleTMRNAi Transcription Kit方法設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄shRNA的對(duì)應(yīng)于Stat3基因的回文序列(各為53bp)[1]，其上游引物5’-AAA AAG CAG CTG CAC CAG CTG TAC TTC AAG CAA GTA CAG CTG GTG CAG CTG CG-3’，下游引物5’-ACA CCG CAG CTG CAC CAG CTG TAC TTG CTT GAA GTA CAG CTG GTG CAG CTG CT-3’。引物在95 ℃退火后合成雙鏈DNA(dsDNA)，將dsDNA與線狀SilenCircle 載體連接，經(jīng)StuI鑒定連接成功后，用E.coli擴(kuò)增并提取DNA[5]。

1.5膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44的轉(zhuǎn)染

由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞較難轉(zhuǎn)染，將RNAi質(zhì)粒與表達(dá)熒光的熒光質(zhì)粒EGFP-N2進(jìn)行共轉(zhuǎn)來分析轉(zhuǎn)染效率，RNAi質(zhì)粒與熒光質(zhì)粒EGFP-N2的轉(zhuǎn)染比例為3∶1。用只轉(zhuǎn)染EGFP-N2質(zhì)粒的細(xì)胞做對(duì)照組來分析stat3基因表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞凋亡的影響是否具有特異性，共轉(zhuǎn)RNAi載體及EGFP-N2的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組來分析stat3基因表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。具體轉(zhuǎn)染步驟按照LipofectamineTM2000kit進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37℃，50mL/L CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)24～96h，觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果并進(jìn)行基因阻斷分析[1]。

1.6 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞的凋亡

轉(zhuǎn)染3d后，用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)進(jìn)行檢測(cè)(原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)Kit, Santa Cruz Biotechnology)。檢測(cè)當(dāng)天，細(xì)胞涂片經(jīng)空氣干燥后用新制備的4%多聚甲醛溶液(溶于Ph7.4 PBS中)固定，室溫30min。PBS洗片后，與阻斷劑(0.3%H2O2甲醇溶液)室溫孵育30min, PBS洗片，與通透液(0.1% Triton X-100溶于0.1%枸櫞酸鈉溶液中)在冰浴中孵育2min。PBS沖洗2次，擦干樣品周圍的水，滴加50uL的TUNEL反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃孵育60min。PBS沖洗3次后，至此樣品可在熒光鏡(Nikon)下分析結(jié)果，凋亡細(xì)胞可表達(dá)明顯熒光。

1.7 細(xì)胞總RNA的提取及RT-PCR分析

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別按標(biāo)準(zhǔn)方法提取中RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA，Stat3 PCR引物設(shè)計(jì)為5’-GGG TCT GGC TAG ACA ATA TCA TCG-3’和5’-CAC TAC CTG GGT CGG CTT CG-3’以及作為內(nèi)參的β-actin引物設(shè)計(jì)為5’-CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3’和5’-AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C-3’。Stat3 PCR產(chǎn)物大小為420bp, β-actin PCR產(chǎn)物大小為590 bp。PCR擴(kuò)增條件為：①95℃1min；②30個(gè)循環(huán) (95℃ 45s；55℃ 2min；72℃ 90s)；③72℃ 10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Stat3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)的鑒定和定位

Stat3蛋白為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白，它能介導(dǎo)外接的信號(hào)分子被磷酸化從而進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控基因的表達(dá)。用Stat3蛋白的特異性抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)正常狀態(tài)下生長(zhǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG44表達(dá)Stat3蛋白(見圖1a)[1]，并且在細(xì)胞核部位染色明顯(見圖1b)。表明Stat3蛋白在正常的SHG44細(xì)胞系中也是通過在核內(nèi)調(diào)控基因的表達(dá)從而維持細(xì)胞的特性。

圖1 a 經(jīng)Stat3免疫反應(yīng)的SHG44細(xì)胞(200×)；b 經(jīng)Stat3免疫反應(yīng), 細(xì)胞核部位染色明顯的SHG44細(xì)胞(400×)

2.2 轉(zhuǎn)染shRNA載體后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變

轉(zhuǎn)染48h后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染有shRNA表達(dá)載體的細(xì)胞與對(duì)照組的細(xì)胞相比形態(tài)發(fā)生顯著變化。經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色，常光下觀察到對(duì)照組細(xì)胞呈原有的形態(tài)，細(xì)胞核染成均一藍(lán)色，胞膜完整連續(xù)(見圖2a)，而轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞變圓、變小，細(xì)胞核固縮、碎裂，染成深藍(lán)色或藍(lán)黑色(見圖2b)。用丫啶橙-溴化乙錠染色，熒光下觀察正常細(xì)胞的細(xì)胞核DNA呈黃色或黃綠色均勻熒光，細(xì)胞質(zhì)的RNA為橘黃色熒光(見圖2c)，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核較小，核固縮呈致密濃染黃綠色，或呈半月形，甚至可見黃綠色碎片(見圖2d)，為凋亡早期的細(xì)胞癥狀。

圖2 a 48h后，經(jīng)蘇木素-伊紅染色，常光下未轉(zhuǎn)染有shRNA表達(dá)載體的對(duì)照組細(xì)胞(200×)；b 48h后，經(jīng)蘇木素-伊紅染色，常光下轉(zhuǎn)染有shRNA表達(dá)載體的細(xì)胞(200×)；c 48h后，經(jīng)丫啶橙-溴化乙錠染色，熒光下未轉(zhuǎn)染有shRNA表達(dá)載體的對(duì)照組細(xì)胞(200×)；d 48h后，經(jīng)丫啶橙-溴化乙錠染色，熒光下轉(zhuǎn)染有shRNA表達(dá)載體的細(xì)胞(200×)

2.3 TUNEL檢測(cè)轉(zhuǎn)染shRNA載體的細(xì)胞

轉(zhuǎn)染3d后，用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)進(jìn)行檢測(cè)，與對(duì)照組相比，熒光下觀察凋亡細(xì)胞有明顯熒光(見圖3a,d)，并且細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯比對(duì)照組增多(見圖3c)。該研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的shRNA表達(dá)載體能夠持續(xù)的表達(dá)shRNA，所產(chǎn)生的shRNA很快的被加工成siRNA，從而達(dá)到了持續(xù)抑制的效果，通過抑制Stat3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，可導(dǎo)致了細(xì)胞的凋亡，并進(jìn)一步表明Stat3蛋白在正常的SHG44細(xì)胞系中，是通過在核內(nèi)調(diào)控基因的表達(dá)來維持細(xì)胞特性的。

圖3 用TUNEL技術(shù)檢測(cè)后的SHG44細(xì)胞 a TUNEL作用下凋亡細(xì)胞熒光下顯色;b 常光下的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，有凋亡現(xiàn)象;d 轉(zhuǎn)染shRNA載體的細(xì)胞比對(duì)照組 c 相比，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多。

2.4 RT-PCR分析

培養(yǎng)5d后，用Trizol抽提總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用其作為模板，用Stat3特異性的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。對(duì)照組中Stat3的mRNA的表達(dá)量明顯大于實(shí)驗(yàn)組中Stat3的mRNA表達(dá)量(見圖4)[1]。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組中Stat3基因的表達(dá)被RNA干擾載體有效抑制。因此，Stat3蛋白對(duì)維持膠質(zhì)瘤細(xì)胞的正常生長(zhǎng)有重要作用，抑制Stat3蛋白的表達(dá)會(huì)引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，都用β-actin作為陽性對(duì)照。

圖4 轉(zhuǎn)染5d后Stat3的mRNA表達(dá)量。C為對(duì)照組細(xì)胞的表達(dá)量，T為轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)量。β-actin為陽性對(duì)照3討論

腦膠質(zhì)瘤作為一種常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，目前傳統(tǒng)的治療方法并不能徹底將其治愈。近年來的基因治療是以膠質(zhì)瘤中的特異基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行研究，以確定基因的具體作用并針對(duì)性進(jìn)行研究。Rahaman S等發(fā)現(xiàn)Stat3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中有表達(dá)。由于Stat3蛋白作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白，它能介導(dǎo)外接的信號(hào)分子被磷酸化從而進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控基因的表達(dá)。用Stat3的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，可知膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)Stat3蛋白并在細(xì)胞核部位染色明顯。目前已有學(xué)者以Stat3為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤治療研究，取得了初步結(jié)果，但有關(guān)Stat3的詳細(xì)作用機(jī)制尚未明確，有待于進(jìn)一步深入研究。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Stat3蛋白在膠質(zhì)瘤中的具體作用，利用RNAi的方法構(gòu)建了shRNA表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG44中以抑制其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在形態(tài)和生物學(xué)特征方面都發(fā)生了明顯的變化；用TUNEL標(biāo)記可見細(xì)胞有凋亡特征；RT-PCR檢測(cè)抑制后的Stat3在膠質(zhì)瘤中表達(dá)量明顯減少。

結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Stat3的低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。由此推測(cè)，在腦膠質(zhì)瘤中下調(diào)該基因的表達(dá)也將使腫瘤細(xì)胞凋亡。這將為體內(nèi)研究Stat3對(duì)膠質(zhì)瘤的作用及作用機(jī)制，并為腦膠質(zhì)瘤這一顱內(nèi)惡性腫瘤的基因治療提供一種新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]段燕紅，任雯雯，錢艷蓉，等.層連蛋白受體67LR在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中作用的研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17(4)：52.