林禹欣,劉惠麟,韓葳葳,詹冬玲,劉景圣

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,長(zhǎng)春 130118；2.吉林大學(xué) 分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春 130012)

有機(jī)磷農(nóng)藥常被用作殺蟲劑噴灑在果樹(shù)和蔬菜上,主要通過(guò)與膽堿酯酶的活性內(nèi)羥基結(jié)合抑制酶活性,使其失去分解乙酰膽堿的能力,導(dǎo)致乙酰膽堿的積累[1].

磷酸三酯酶(phosphotriesterase,PTE,EC31118)是降解有機(jī)磷毒劑的主要酶類,可與水果蔬菜表面殘留的農(nóng)藥發(fā)生化學(xué)反應(yīng),破壞有毒成分的化學(xué)結(jié)構(gòu),使其變?yōu)闊o(wú)毒、可溶于水的小分子物質(zhì)[2-4].

嗜熱酶具有較高的熱穩(wěn)定性和高抗性[5-7].嗜熱磷酸三酯酶由于具有較高的熱穩(wěn)定性及可溶性而使其在實(shí)際應(yīng)用中潛力較大.目前發(fā)現(xiàn)的嗜熱磷酸三酯酶主要包括嗜熱菌Deinococcusradiodurans來(lái)源的磷酸三酯酶(Dr-OPH)、超嗜熱菌Sulfololussolfataricus來(lái)源的磷酸三酯酶(SsoPox)和嗜熱菌Geobacilluskaustophilus來(lái)源的磷酸三酯酶[2].

本文通過(guò)克隆ThermaerobactersubterraneusDSM13965的磷酸三酯酶(PTE)基因,用雙酶切將其與質(zhì)粒pET15b連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),利用His抗體鑒定目標(biāo)蛋白,并研究重組蛋白(DSM-PTE)的酶學(xué)性質(zhì).

1 材料與方法

1.1 材 料

嗜熱菌T.subterraneusDSM13965購(gòu)自德國(guó)菌種保藏中心；大腸桿菌BL21及質(zhì)粒pET15b為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；DNA快速提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購(gòu)自杭州維特潔生化技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4-DNA連接酶及瓊脂糖為荷蘭Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品；其他試劑均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品.由上海生物工程有限公司對(duì)引物進(jìn)行合成和測(cè)序.

1.2 方 法

1.2.1 同源序列比對(duì) 分別將T.subterraneusDSM13965的有機(jī)磷水解酶、來(lái)自G.KaustophilusHTA426的磷酸三酯酶、來(lái)自S.solfataricus的內(nèi)酯酶/磷酸三酯酶和來(lái)自D.Radiodurans的有機(jī)磷水解酶進(jìn)行同源序列比對(duì).

1.2.2 嗜熱菌T.subterraneusDSM13965基因組DNA的調(diào)取 按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIAGEN)說(shuō)明提取TS基因組DNA,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的純度和濃度,分裝后于-40 ℃保存?zhèn)溆?

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸10 min,循環(huán)30次,72 ℃延伸20 min.通過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,目的基因片段于-20 ℃保存.

1.2.4 磷酸三酯酶基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 由DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,將PCR產(chǎn)物連接至pET-15b上,轉(zhuǎn)化入E.coliXL中.將篩選到含PTE的陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙酶切和序列分析.對(duì)陽(yáng)性克隆和質(zhì)粒pET-15b分別進(jìn)行NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切,將酶切得到的目的基因與雙酶切后載體pET-15b相連.連接反應(yīng)體系為:T4 DNA連接酶0.3 μL,T4 DNA連接酶緩沖液1.2 μL,雙酶切后的載體pET-15b 1.5 μL,雙酶切后的目的基因片段7 μL.

將反應(yīng)物置于16 ℃金屬浴中連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliBL21中.挑取單菌落,培養(yǎng)并提取質(zhì)粒,通過(guò)PCR對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行篩選和序列分析.

1.2.5 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物純化 將工程菌接種于含100 μg/mL氨芐青霉素(AMP)的10 mL Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中,于37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,再按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1%接種量接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中,相同條件下培養(yǎng)至A600=0.6～0.8,加入異丙基-β-D-硫代砒喃半乳糖苷(IPTG,終濃度為0.3 mmol/L),30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)夜.于4 ℃,6 000 r/min離心收集菌體,并懸浮于50 mmol/L pH=7.5的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液中,在冰浴中超聲裂菌,60 ℃熱處理30 min,離心,棄沉淀,上清液經(jīng)鎳柱純化,收集蛋白峰.融合蛋白部分經(jīng)聚乙二醇(10 000)濃縮后,檢測(cè)酶活.

1.2.6 磷酸三酯酶鑒定 用SDS-PAGE和Western-blot分析鑒定純化后得到的目標(biāo)蛋白[8-9].通過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的分離膠變性蛋白電泳進(jìn)行檢測(cè).

1.2.7 磷酸三酯酶的活力測(cè)定 以甲基對(duì)氧磷(methyl-paraoxon)為底物,通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定磷酸三酯酶活力.監(jiān)測(cè)水解產(chǎn)物對(duì)硝基酚在405 nm隨時(shí)間變化的光吸收值,反應(yīng)體系為2 mL,緩沖體系為50 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.5),甲基對(duì)氧磷的終濃度為0.1 mmol/L,加入適量的酶,70 ℃反應(yīng)20 min,用T6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)的光吸收值,以不加入酶的體系作為空白對(duì)照.1個(gè)酶活力單位為每20 min催化水解1 μmol底物所需的酶量.酶比活計(jì)算公式如下：

其中:Δ OD405為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)405 nm處光吸收強(qiáng)度的變化值；V1為反應(yīng)體系 (2 mL)；ε為消光系數(shù)(0.016(μmol/L)-1)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；V2為加入的酶量(mL)；ρ為酶的質(zhì)量濃度(mg/mL).每次做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),取平均值.

1.2.8 最適pH值及溫度的測(cè)定 分別以三羥甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、2-嗎啉乙磺酸(MES)、3-(環(huán)己胺)-1-丙磺酸(CAPS)和4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)配制不同pH值的緩沖液,酶活性測(cè)定方法同1.2.7.在pH=4～11內(nèi)檢測(cè)酶活力,最高酶活力設(shè)為100%,以相對(duì)活性為縱坐標(biāo)對(duì)pH值做圖,求得最適pH值.

在30～90 ℃內(nèi)測(cè)定融合蛋白的磷酸三酯酶活力,觀察溫度對(duì)酶活性的影響.最高酶活性設(shè)為100%,以相對(duì)活性為縱坐標(biāo)對(duì)溫度做圖,求得最適溫度.

1.2.9 熱穩(wěn)定性測(cè)定 將PTE純化酶液置于70 ℃水浴中,用石蠟油封頂,每間隔1 h取一次酶液進(jìn)行活力測(cè)定.磷酸三酯酶活力測(cè)定同1.2.7.

2 結(jié)果與討論

2.1 同源序列比對(duì)結(jié)果

通過(guò)NCBI的protein blast檢索發(fā)現(xiàn),與DSM-PTE同源性高的蛋白主要都是有機(jī)磷水解酶.將已知結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷水解酶[10-11]和DSM-PTE進(jìn)行同源序列比對(duì),結(jié)果如圖1所示.

DSM為T.subterraneus DSM13965的有機(jī)磷水解酶(同源性99%)；3ORW為G.kaustophilus HTA426的磷酸三酯酶(同源性62%)；2VC5為S.solfataricus的內(nèi)酯酶/磷酸三酯酶 (同源性35%)；3GU1為D.radiodurans的磷酸三酯酶(同源性61%).圖 1 DSM-PTE同源序列比對(duì)Fig.1 Sequence alignment of DSM-PTE with other members

由圖1可見(jiàn),其同源性均大于35%,推測(cè)DSM-PTE具有有機(jī)磷水解酶的活性.

2.2 磷酸三酯酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

TS基因組的調(diào)取結(jié)果如圖2所示.由圖2可見(jiàn),TS基因組提取準(zhǔn)確,以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示.由圖3可見(jiàn),目的片段(約1 000 bp)成功插入,與預(yù)期大小一致,序列測(cè)定結(jié)果表明,所獲目的基因正確.

2.3 重組蛋白DSM-PTE的表達(dá)與純化

用SDS-PAGE檢驗(yàn)純化蛋白組分,結(jié)果如圖4所示.由圖4的第2條帶可見(jiàn),重組蛋白的相對(duì)分子量為50 000,主要以二聚體形式存在.由Western-blot(第3條帶)的免疫印跡可見(jiàn),重組蛋白DSM-PTE是約為50 000的大分子化合物.與文獻(xiàn)[12]結(jié)果相符,PTE在溶液中主要以單體和二聚體的形式存在.

圖2 TS基因組的調(diào)取 圖3 磷酸三酯酶基因的調(diào)取 圖4 PTE蛋白純化電泳 Fig.2 Extraction of TS genome Fig.3 Extraction of PTE gene Fig.4 SDS-PAGE of purified PTE

2.4 最適溫度與pH值

本文以甲基對(duì)氧磷為底物,利用分光光度計(jì)測(cè)定磷酸三酯酶的活力.溫度和pH值的相對(duì)活力曲線如圖5所示.由圖5(A)可見(jiàn),在70～90 ℃內(nèi),酶的相對(duì)活力均大于50%,其最適溫度為70 ℃；在30～60 ℃內(nèi),酶的相對(duì)活力均低于50%.表明異源表達(dá)的磷酸三酯酶是對(duì)溫度敏感的高溫酶.

圖5 磷酸三酯酶的最適溫度(A)和pH值(B)Fig.5 Optimal temperature (A) and pH (B) of PTE

在70 ℃,TAPS,MES,CAPS和HEPES的緩沖液中,以甲基對(duì)氧磷作為底物,在pH=4.0～11.0內(nèi)檢測(cè)磷酸三酯酶酶活力.由圖5(B)可見(jiàn),酶相對(duì)活力最高的pH=10.0.當(dāng)pH=7.0～11.0時(shí),酶的相對(duì)活力均大于50%,當(dāng)pH=4.0～6.0時(shí),酶的相對(duì)活力低于40%,表明重組磷酸三酯酶適合中性偏堿的環(huán)境,是一種典型的堿性磷酸水解酶.

2.5 熱穩(wěn)定性

磷酸三酯酶在70 ℃的相對(duì)活力與時(shí)間變化關(guān)系如圖6所示.由圖6可見(jiàn),DSM-PTE具有較好的熱穩(wěn)定性.工程菌分泌的磷酸三酯酶PTE主要以二聚體形式存在,酶活力隨時(shí)間的增加而逐漸減弱,這是因?yàn)槎垠w解聚至無(wú)活力的單體所致,其半衰期為1 h.

圖6 PTE的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of PTE

綜上所述,嗜熱菌T.subterraneusDSM13965的磷酸水解酶基因編碼產(chǎn)物主要以二聚體的形式存在,并具有磷酸三酯酶的活性,在高溫下有良好的穩(wěn)定性.

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