張鳳瑞,周 賢,劉 炎,翁麗麗,王淑敏＊,韓雪華

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),吉林 長(zhǎng)春 130117;2.延邊大學(xué),吉林延吉133000)

當(dāng)歸補(bǔ)血湯系中醫(yī)經(jīng)典名方,始載于李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》,按黃芪∶當(dāng)歸(5∶1)組成,具補(bǔ)氣生血等功效,多用于治勞倦內(nèi)傷,氣血虛,陽(yáng)浮于外之虛熱證?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)造血、調(diào)節(jié)免疫功能、保護(hù)心腦血管等作用。本文以黃芪及其所含的黃芪甲苷成分為定性和定量指標(biāo)進(jìn)行薄層鑒別和含量測(cè)定,建立本品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

Waters 600液相色譜分離系統(tǒng),Agilent 1100自動(dòng)進(jìn)樣器,Alltech ELSD-2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。黃芪藥材為膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.當(dāng)歸藥材為當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diel.購(gòu)于長(zhǎng)春市仙草藥材有限公司;乙腈為美國(guó)Fischer公司生產(chǎn),色譜醇;其它試劑為分析純;Milli-Q超純水。黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)0781-200210,供含量測(cè)定用)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯供試品制備 取當(dāng)歸飲片10 g,黃芪飲片50 g合煎,分別加入8、6倍水,煎煮2次,每次1 h,合并煎液,濾過(guò),烘干,得浸膏。取1 g浸膏,加蒸餾水20 mL溶解,用水飽和正丁醇萃取 4次,每次40 mL,合并正丁醇液,蒸干,用甲醇定容到5 mL。用0.45 μ mol濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.2 黃芪對(duì)照藥材供試品制備 取黃芪對(duì)照藥材50 g,分別加入 8、6倍水 ,煎煮2次 ,每次1 h,合并煎液,濾過(guò),烘干,得浸膏。取1 g浸膏,同2.1中方法制備黃芪對(duì)照藥材供試品溶液。

2.3 黃芪陰性對(duì)照供試品制備 取當(dāng)歸對(duì)照藥材50 g,分別加入 8、6倍水 ,煎煮2次 ,每次1 h,合并煎液,濾過(guò),烘干,得浸膏。取1 g浸膏,同2.1中方法制備陰性對(duì)照藥材供試品溶液。

2.4 黃芪甲苷對(duì)照品制備 精密稱取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品,加甲醇配成1.01 mg/mL的溶液,即得。

2.5 色譜條件 色譜柱:Diamonsil ODS-C18(5 μ,250 mm×4.6 mm)分析柱;流動(dòng)相:乙腈-水(32∶68);流速:0.6 mL/min;柱溫:35℃;載氣流速:

2.7 mL/min;ELSD檢測(cè)器漂移管溫度:100℃;進(jìn)樣量20 μ L 。

2.6 黃芪薄層色譜鑒別 取當(dāng)歸補(bǔ)血湯浸膏1 g,加甲醇20 mL,加熱回流1 h,濾過(guò),濾液加于中性氧化鋁柱(100～120目,5g,內(nèi)徑為10～15mm)上,用40%甲醇100mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘?jiān)铀?0mL使溶解,用水飽和的正丁醇振搖提取 2次,每次20 mL,合并正丁醇液,用水洗滌 2次,每次20 mL,棄去水液,正丁醇液蒸干,殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解,作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材浸膏1 g,同法制成對(duì)照藥材溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn),吸取上述3種溶液和甲醇空白對(duì)照溶液各2 μ L,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。日光下檢視,供試品、對(duì)照藥材、黃芪甲苷在相同的位置具有相同的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪薄層色譜鑒別

2.7 黃芪甲苷含量測(cè)定[1-3]

2.7.1 方法學(xué)考察

2.7.1.1 線性關(guān)系考察 取黃芪甲苷對(duì)照品溶液(1.01 mg/mL),分 別進(jìn) 樣 1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μ L,記錄峰面積 ,以黃芪甲苷進(jìn)樣量(μ g)的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),峰面積的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為:lgY=4 816 28lgX+317 832,r=0.999 7。結(jié)果表明,黃芪甲苷在1.01～20.2 μ g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.1.2 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液,進(jìn)樣10 μ L,重復(fù)進(jìn)樣 5次,測(cè)定峰面積積分值分別為5 044 367,5 001 365,5 033 698,5 019 963,5 009 430,RSD=0.35%,精密度較好。

2.7.1.3 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液,定時(shí)(1,2,4,8,12 h)進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)樣各 20 μ L,測(cè)定峰面積積分值分別為,5 054 367,4 892 365,4 903 698,5 049 963,5 009 430,RSD=1.6%,穩(wěn)定性較好。

2.7.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定樣品3份,按照2.1項(xiàng)下方法制備樣品溶液,計(jì)算含量測(cè)定結(jié)果分別為1.512,1.451 2,1.389 8,1.447 7,1.448 5 mg/g,RSD=2.98%,重復(fù)性良好。

2.7.1.5 回收率試驗(yàn) 精密稱定已知黃芪甲苷含量為1.448 5 mg/g的樣品3份,每份各 1.0 g,分別精密加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液(1.01 mg/mL)1 mL,按照“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液,計(jì)算含量測(cè)定結(jié)果分別為2.437 3,2.371 6,2.431 2,2.472 4,2.389 2 mg/g,平均回收率為95.04%,RSD=1.66%。

2.7.2 樣品測(cè)定 取3批當(dāng)歸補(bǔ)血湯藥材,按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,根據(jù)黃芪甲苷的線性回歸方程,計(jì)算黃芪甲苷含量,結(jié)果當(dāng)歸補(bǔ)血湯分別為1.448 5,1.443 6,1.451 2 mg/g,均值為1.447 8 mg/g。

3 小結(jié)

采用薄層色譜鑒別黃芪專屬性好,高效液相色譜檢測(cè)黃芪甲苷在1.01～20.2 μ g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,平均加樣回收率為95.04%,RSD=0.61%。所建立方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好,可用于當(dāng)歸補(bǔ)血湯的質(zhì)量控制。

[1]王寶,蘇健,魯靜.黃芪甲甙的檢測(cè)在中藥質(zhì)控中的應(yīng)用[J].中國(guó)中藥雜志,1996,21(3):161.

[2]俞家華,曹正中,張勤.膜莢黃芪中黃芪甲苷的含量測(cè)定[J].中藥通報(bào),1986,11(9):38.

[3]肖紅,于淼.北芪精口服液中黃芪甲苷的測(cè)定[J].長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,19(4):49.