楊志英，鄧志剛，伍健明，藍偉紅，張茂祥

在癌癥和飲食的相關(guān)性越來越強的今天，天然抗癌食物倍受重視，芹菜素作為食物提取物也被人們廣泛關(guān)注。國內(nèi)外試驗研究表明，芹菜素具有廣譜的抗瘤性[1]，包括前列腺癌[2]、乳腺癌[3]、肺癌[4]、宮頸癌[5]、結(jié)腸癌[6]等，然而目前芹菜素對中樞神經(jīng)腫瘤——膠質(zhì)瘤是否具有抑制作用，卻鮮見國內(nèi)外報道。本研究旨在通過對體外培養(yǎng)的U251人膠質(zhì)瘤細胞進行實驗，探討芹菜素是否對膠質(zhì)瘤細胞生長及p21、p53 表達有影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

1.1.1 細胞系 膠質(zhì)瘤細胞株 U251 購于中科院上海細胞所。

1.1.2 主要試劑 芹菜素購于美國 Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶購于美國 Amresco公司；苯甲基硫酰氟（PMSF）購于美國 Promega公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基、噻唑藍（MTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）購于Gibco公司；鼠單克隆抗人 p21和p53 抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗購于美國 Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物配置 膠質(zhì)瘤 U251 細胞置于細胞培養(yǎng)箱中，RPMI 1640 培養(yǎng)液常規(guī)傳代，取其生長對數(shù)期的細胞用于實驗。100% DMSO 溶解芹菜素，配制成 40 mmol/L的濃縮液，于–20 ℃貯存?zhèn)溆?。實驗時加入完全培養(yǎng)基以配制濃度分別為20、40、80 μmol/L的芹菜素工作液，以完全培養(yǎng)基為對照組。

1.2.2 MTT 法檢測芹菜素對 U251 膠質(zhì)瘤細胞增殖抑制率 消化液消化 U251 膠質(zhì)瘤細胞，以全培養(yǎng)液終止并調(diào)整細胞密度至 1×105個/L，接種于96 孔板，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h。吸去舊培養(yǎng)液，加入終濃度為0（對照組）、20、40、80 μmol/L的芹菜素工作液，分別培養(yǎng) 24、48及72 h。加入新鮮配制的MTT，培養(yǎng) 4 h，取出，棄上清，加入 DMSO，置于搖床振蕩 10 min，至顆粒完全溶解后，于酶標儀測吸光度值（A 值），測定波長為570 nm。每組設 5個平行孔，實驗重復 3 次。計算細胞抑制率，公式為：細胞抑制率（%）=（A對照組－A處理組）/A對照組×100%。

1.2.3 Western blot 檢測芹菜素對 U251 膠質(zhì)瘤細胞 p21和p53蛋白表達的影響 U251 膠質(zhì)瘤細胞分別用不同濃度(0、20、40、80 μmol/L)的芹菜素工作液處理 48 h，收集細胞，3000 r/min 離心10 min 后，冰 PBS 沖洗，加入細胞裂解液，于冰上裂解 1 h 后，13000 r/min 離心 10 min，收集上清。測定蛋白含量采用 Folin-酚試劑法。加入上樣緩沖液后加熱使其變性，凝膠電泳以分離蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)移蛋白帶至 PVDF 膜上，封閉液封閉蛋白結(jié)合位點 2 h。加入 p53、p21 一抗(按 1∶1000 倍稀釋)，4 ℃ 孵育過夜。加相應辣根過氧化物酶標記的二抗(按 1∶2000 倍稀釋)，室溫孵育 1 h。以ECL 顯色系統(tǒng)顯色。采用 WO-9413B 型凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件 Gelpro 32 分析膠片中的蛋白條帶，以各組灰度面積的乘積/內(nèi)參照（β-actin）灰度面積的乘積反映相對蛋白表達豐度。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制作用

20 μmol/L的芹菜素抑制膠質(zhì)瘤 U251 細胞增殖的作用不明顯（P ＞0.05），24、48、72 h的抑制率分別為3.07%±0.13%、3.98%±0.15%、4.86%±0.21%。而 40 μmol/L 及80 μmol/L的芹菜素抑制膠質(zhì)瘤 U251 細胞增殖（P＜0.05），其 24、48、72 h的抑制率分別為19.12%±0.22%、28.79%±0.18%、36.53%±0.19% 及37.41%±0.16%、45.86%±0.23%、54.25%±0.24%，呈現(xiàn)時間和劑量依賴性，見圖 1。

圖1 不同濃度芹菜素對 U251 膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響Figure1 Effect of apigenin with various concentrations on proliferation of glioma cell line U251

2.2 芹菜素對膠質(zhì)瘤細胞 p53和p21 表達的影響

Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，芹菜素可以上調(diào) U251膠質(zhì)瘤細胞中 p53和p21蛋白的表達，且隨著芹菜素濃度的增加，蛋白表達逐漸增加，結(jié)果見圖 2及圖 3。

圖2 不同濃度芹菜素對膠質(zhì)瘤細胞 p53和p21蛋白表達的影響Figure2 Effect of apigenin with various concentrations on p21, p53 protein expression in glioma cell line U251

圖3 不同濃度芹菜素對膠質(zhì)瘤細胞 p53和p21蛋白表達的影響Figure3 Effect of apigenin with various concentrations on p21, p53 protein expression in glioma cell line U251

3 討論

膠質(zhì)瘤是居中樞神經(jīng)系統(tǒng)首位的惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的40% 以上，其特點是發(fā)病率高，早期診斷難，治愈率低，易復發(fā)及易死亡[7]。目前臨床膠質(zhì)瘤常規(guī)是采用顯微手術(shù)切除、放療和化療為一體的治療方案[7]。對于膠質(zhì)瘤患者，尤其是高度惡性的患者，化療在治療中的重要性是明確并肯定的。然而，膠質(zhì)瘤的不均質(zhì)性，致使其對傳統(tǒng)化療藥物不敏感，導致整體治療效果不理想，并且毒副作用明顯，患者耐受性差，預后也不理想。因此，尋找治療膠質(zhì)瘤新藥，設計新的膠質(zhì)瘤化療方案具有重要的臨床意義。

芹菜素，也稱為芹黃素、洋芹素、芹菜配基等，是一種廣泛存在于多種食用植物中的黃酮類化合物，其中以芹菜根的含量最為豐富。化學結(jié)構(gòu)上3個烴基以及C2=C3雙鍵的存在，使之擁有相對獨特的藥理學效應和生物學特性。其具有多種生物活性[8]，如抗病毒、抗炎癥、抗突變、抗腫瘤、抗氧化、抗焦慮、保護心血管、保護中樞神經(jīng)等，其中以抗腫瘤作用最為人關(guān)注。

正常細胞的增殖取決于癌基因和抑癌基因的平衡調(diào)節(jié)。p53和p21是目前關(guān)注較多的抑癌基因。p53 表達產(chǎn)物 p53蛋白為基因調(diào)節(jié)蛋白，具有調(diào)節(jié)細胞周期的作用。倘若 p53 基因發(fā)生突變，p53蛋白失活，細胞分裂也將失去節(jié)制，造成細胞惡變[9]。反之，如果 p53 基因穩(wěn)定，p53蛋白表達水平升高，則能導致腫瘤細胞周期停滯甚至細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的生長[10]。而 p21 基因編碼的p21蛋白為核內(nèi)蛋白，同樣對調(diào)控細胞生長、分化具有重要作用。p21蛋白水平的異常直接影響細胞的發(fā)展方向，也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系[11]。相關(guān)研究表明，芹菜素在體外能夠顯著抑制多種腫瘤細胞的增殖。當前已知的作用機制主要圍繞以下三個方面：細胞周期阻滯[2-3]、誘導細胞凋亡[4-6]及抑制腫瘤血管的生成[12]。本研究結(jié)果顯示，芹菜素在體外呈劑量及時間依賴性地抑制膠質(zhì)瘤U251 細胞增殖，并能上調(diào) U251 膠質(zhì)瘤細胞中p53和p21蛋白的表達，且作用呈濃度依賴性。根據(jù)上述研究結(jié)果，我們推測，芹菜素可能通過激活 p53 途徑，增加 p53的穩(wěn)定性，使 U251 膠質(zhì)瘤細胞內(nèi) p53和p21蛋白表達水平升高，進而誘導 U251 膠質(zhì)瘤細胞阻滯，將細胞周期阻滯在某一時期，并通過 p53 途徑誘導 U251 膠質(zhì)瘤細胞凋亡，從而抑制腦膠質(zhì)瘤細胞體外生長。Freitas等[12]近期的研究表明，芹菜素減少 GL15人膠質(zhì)瘤細胞中 VEGF 及TGF-β1的含量，而作為已確認具有抑制內(nèi)皮細胞增殖及血管形成作用并已上市的重組人單克隆抗體貝伐單抗，在此研究中，僅僅減少了 VEGF的含量。至于芹菜素更進一步的作用機制，該研究并未涉及。其是否通過本研究中的p53途徑？芹菜素在活體研究中效果如何？這些問題都值得我們進一步研究。

本研究結(jié)果為芹菜素用于治療膠質(zhì)瘤提供了實驗室依據(jù)，提示其可能為有效的膠質(zhì)瘤化療新藥之一。而作為食源性提取物，芹菜素用作腫瘤臨床化療方案，與傳統(tǒng)化療藥物相比，具有較可靠的藥物安全性、較好的耐受性及較輕的毒副作用，是天然抗腫瘤藥物，前景廣闊，相信對其深度的藥物研發(fā)，將進一步提高膠質(zhì)瘤患者的生活質(zhì)量，延長患者的生存時間。

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