吳 健 劉紅芝 張 芳 付燕燕 王淑玲 宋遠(yuǎn)見(jiàn)

(1.徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)學(xué)院 附屬市立醫(yī)院，江蘇 徐州221000)

0 引言

Akt信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，參與細(xì)胞凋亡及糖代謝過(guò)程，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的重要樞鈕之一。Akt1信號(hào)通路是腫瘤細(xì)胞中最活躍的通路之一，Akt1基因在多種腫瘤組織中存在過(guò)表達(dá)[1]。探討Akt1基因的功能對(duì)于研究細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生和發(fā)展具有重要意義，Akt1基因的體外合成和構(gòu)建真核細(xì)胞基因表達(dá)質(zhì)?？梢詾锳kt1基因功能及相關(guān)疾病的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Pfu DNA polymerase購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，瓊脂糖和DNA凝膠回收試劑盒（離心柱型）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，DNA內(nèi)切酶、DNA連接酶和DNA marker均購(gòu)自MBI Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 用PCR方法對(duì)大鼠Akt1序列進(jìn)行基因合成

1）oligo設(shè)計(jì)合成，目的基因上下游分別加上NheI和BamHI及保護(hù)堿基，用于基因合成后的亞克隆。

2）oligo合成。

3）將oligo溶解成50μM，將oligo分別取相同體積至1.5ml離心管，混合均勻，配成oligo mix。

4）用配制好的oligo mix進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，循環(huán)條件：95℃3min 1 cycle；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec 30 cycles；72℃ 5min 1 cycle。

5）第二輪PCR反應(yīng)，模板為第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。反應(yīng)條件與第一輪相同。第一輪PCR可得到混有目的基因條帶的非單一條帶PCR產(chǎn)物混合物，再用第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，通過(guò)第二輪PCR則可獲得單一的目的基因條帶。

6）電泳，回收大鼠Akt1基因片段。

1.2.2 大鼠Akt1克隆到pGCMV/MCS/RFP/Neo中并用酶切法驗(yàn)證

1）用NheI和BamHI對(duì)大鼠Akt1基因的片段進(jìn)行酶切，37℃酶切2小時(shí)；

2）用 NheI和 BamHI對(duì) pGCMV/MCS/RFP/Neo進(jìn)行酶切，37℃酶切2小時(shí)；

3）電泳，用DNA凝膠回收試劑盒回收雙酶切的大鼠Akt1基因片段和載體pGCMV/MCS/RFP/Neo；

4）用T4 DNA ligase連接雙酶切得到的大鼠Akt1基因片段和線性化的載體，22℃連接2小時(shí)；

5）取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μl感受態(tài)細(xì)胞Top10，均勻涂布于50μg/ml Ampicillin平板，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約16小時(shí)；

6）挑取陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒，用酶切法驗(yàn)證。

2 結(jié)果

大鼠Akt1 PCR電泳圖片如圖1所示。

大鼠Akt1-pGCMV/MCS/RFP/Neo重組質(zhì)粒NheI和BamHI雙酶切鑒定圖片如圖2。

圖1 大鼠Akt1 PCR電泳1.大鼠 Akt1 PCR；2.marker MBI SM0331；3.marker MBI SM0331.

圖2 大鼠Akt1-pGCMV/MCS/RFP/Neo重組質(zhì)粒NheI和BamHI雙酶切鑒定4.重組質(zhì)粒 NheI和 BamHI雙酶切；5.marker MBI SM0331.

3 討論

蛋白激酶B(Akt)是絲／蘇氨酸激酶家族成員，是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要樞鈕之一。Akt的功能復(fù)雜多樣，其底物迄今已發(fā)現(xiàn)有50余種蛋白[2]。 哺乳動(dòng)物基因組中有三種 Akt，即 Akt1、Akt2，Akt3，在腦中 Akt1的含量最高，其活性的下降與腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡相關(guān)[3]。Akt參與細(xì)胞增殖和凋亡等多方面的調(diào)節(jié)，是細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控中樞。Akt是原癌基因，細(xì)胞內(nèi)的P13K可促進(jìn)Akt的激活，后者再激活mTOR，從而調(diào)控細(xì)胞周期，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在肝癌、胃癌、血癌、胰腺癌等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號(hào)通路的活化[4]。

體外合成Akt1基因并構(gòu)建真核細(xì)胞基因表達(dá)載體可用于該基因相關(guān)功能和機(jī)制的研究，從而為腦缺血損傷、腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面提供重要基礎(chǔ)。

［1］黃秀蘭，崔國(guó)輝，周克元，等.PI3K-Akt信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究進(jìn)展[J].癌癥，2008，27（03）：331-336.

［2］AyraI-Kaloustian S,Gu J,Lucas J,et a1.Hybrid inhibitors of phosphotedylinositol 3-kinase(PI3K)and the mammalian target of rapamycin(mTOR):design,synthesis,and superiorantitumoractivity ofnovelwortmannin-rapamycin conjugates[J].Med Chem，2010，53（01）： 452-459.

［3］劉革修.腦缺血損傷與 Akt研究的進(jìn)展[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9（21）：167-169.

［4］Missiaglia E,Dalai I,Barbi S,et al.Pancreatic endocrine tumors:expression profiling evidences a role for Akt-mTOR pathway[J].J Clin Oncol，2010，28（02）：245-255.