陳美元

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福州 350014）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）雜交菌株As2796是福建省蘑菇菌種研究推廣站（現(xiàn)福建省農(nóng)科院食用菌研究所）選育成功的優(yōu)良商業(yè)蘑菇菌株，多年來一直占據(jù)中國雙孢蘑菇栽培面積的80%以上[1]。在該菌株多年的保藏復(fù)壯、生產(chǎn)供應(yīng)的過程中偶然發(fā)現(xiàn)了 2株退化突變體 2796-3和2796-5。它們在PDA培養(yǎng)基上生長基本正常，但在糞草培養(yǎng)基、棉籽殼培養(yǎng)基和麥粒培養(yǎng)基上均無法正常生長，在基質(zhì)特別是多糖類基質(zhì)的降解能力上發(fā)生了嚴(yán)重的變異和退化現(xiàn)象。這樣的變異菌種如果流入市場，在 PDA斜面上不斷擴繁成一級母種，而在生產(chǎn)季節(jié)卻不能及時制作成二級種和三級種，將造成供種單位和制種戶極大的經(jīng)濟和信譽損失，并將直接損害廣大菇農(nóng)的利益。經(jīng)研究，我們排除了病毒等微生物感染的因素，證明了該退化性狀是基因變異所引起的，并且可以穩(wěn)定遺傳。

由于 As2796菌株的重要性以及它所具有的雙孢蘑菇商品化雜交菌株的代表性，除了在保藏和供種等方面應(yīng)加強檢測外，對已發(fā)現(xiàn)的該退化現(xiàn)象進行相關(guān)基因表達(dá)差異及分子機制研究具有重要的理論與實際意義。在前期研究中，我們對雙孢蘑菇 As2796正常菌株及其兩個退化突變體進行了mRNA差異顯示（DDRT-PCR）分析[2]，發(fā)現(xiàn)有 9個片段存在明顯的上調(diào)或下調(diào)差異表達(dá)，序列分析發(fā)現(xiàn)9個差異片段代表了5個基因的差異，它們在雙孢蘑菇基因組數(shù)據(jù)庫中的代碼分別為 191327、199816、135047、193267、193513。在本研究中，我們對三個菌株中的這5個基因及其上游部分調(diào)控序列進行克隆與測序比較，以期獲得這些基因與上游序列在三個菌株中的差異，并進一步探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）菌株。雙孢蘑菇雜交菌株As2796及其退化突變體菌株2796-3、2796-5由福建省農(nóng)科院食用菌研究所種質(zhì)資源與遺傳育種研究室保藏并提供。大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α購自上海生工生物工程服務(wù)有限公司。

（2）試劑。Wizard SV Gel and PCR Clean-up System （DNA 膠純化試劑盒）、pGEM-T Easy Vector System （PCR產(chǎn)物克隆試劑盒）及 SV Minipreps DNA Purification System（質(zhì)粒提取試劑盒）購自Promega公司，PCR擴增試劑盒、DNA Markers及其它試劑均購自上海生工生物工程服務(wù)有限公司。

（3）引物。①差異基因編碼序列擴增引物：根據(jù)DDRT-PCR分析中獲得的5個差異基因［2]在雙孢蘑菇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的編碼序列（CDS）設(shè)計正反向PCR引物，用于擴增cDNA中的編碼序列，也可擴增DNA中含內(nèi)含子的編碼序列，引物名稱中的數(shù)字與 DDRT-PCR中的差異片段編號相同，且對應(yīng)基因編號 191327、199816、135047、193267、193513。引物序列見表 1。②差異基因上游調(diào)控序列擴增引物：根據(jù)DDRT-PCR分析中獲得的5個差異基因[2]在雙孢蘑菇基因組數(shù)據(jù)庫中的上游序列設(shè)計正反向PCR引物，用于擴增DNA中差異基因上游約1 200 bp的調(diào)控序列，引物名稱中的數(shù)字與DDRT-PCR中的差異片段編號相同，且對應(yīng)基因編號191327、199816、135047、193267、193513。引物序列見表2。

表1 差異基因編碼序列擴增引物

表2 差異基因上游序列擴增引物

1.2 試驗方法

（1）菌絲的培養(yǎng)。菌種接入常規(guī)PDA斜面培養(yǎng)基，24 ℃培養(yǎng)三周。

（2）總DNA的提取。按美國Sylvan公司提供的方法并加以改進[3]。

（3）目的 DNA片段的擴增。按文獻(xiàn)［4]的方法稍加改動。總體積20 μL反應(yīng)體系中含：10×buffer 2 μL；dNTPs （總 2.5 mmol/L）1.5 μL；模板 DNA（15～20 ng/μL）2 μL；正反向特異引物（約 10 μmol/L）各 1 μL；Pfu（0.5U/μL）2 μL；純水10.5 μL?；靹蚝笤谂_式離心機上稍加離心，放入PCR儀進行下列循環(huán)：94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35 Cycles；72 ℃10 min；4 ℃保持。擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，GeneFinder熒光染料染色拍照。

（4）目的DNA片段的純化、克隆與鑒定。按照 Promega公司 Wizard SV Gel and PCR Clean-up System、pGEM-T Easy Vector System和SV Minipreps DNA Purification System試劑盒說明書進行。

（5）克隆子測序與分析。克隆子質(zhì)粒DNA送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序，獲得的片段序列用DNAMAN軟件進行序列拼接與序列比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常與退化菌株差異基因及其上游序列的擴增與克隆

以雙孢蘑菇As2796及其2個退化菌株的總DNA為模板，用設(shè)計合成的10對特異引物對5個差異基因帶內(nèi)含子的編碼序列及其上游約 1 200 bp調(diào)控序列進行擴增，結(jié)果均獲得了目標(biāo)條帶（圖1，圖2）。割取這些條帶并進行純化，然后克隆到pGEM-T Easy載體中。

2.2 正常與退化菌株差異基因及其上游序列的測序及比較

圖1 3個菌株5個差異基因帶內(nèi)含子CDS的PCR擴增圖

圖2 3個菌株5個差異基因上游序列的PCR擴增圖

圖3 差異基因199816在3個菌株中的序列比較

對克隆子質(zhì)粒進行測序與序列拼接，比較3個菌株間的序列，結(jié)果表明除了差異基因199816在3個菌株中的序列完全一致外（圖3），其余基因與上游序列在三個菌株中均有幾個堿基的差異（圖4）。而這些差異在2個退化菌株中的表現(xiàn)未必一致，重復(fù)擴增與測序的結(jié)果也顯示這些差異并無明顯的規(guī)律性和重復(fù)性。因此它們應(yīng)是PCR擴增及測序過程中產(chǎn)生的誤差，而非實質(zhì)性差異。

圖4 差異基因135047上游序列在3個菌株中的序列比較

3 討 論

食用菌菌種在保藏、制種及后續(xù)的栽培過程中，時有發(fā)生長勢變差、出菇延遲、產(chǎn)量下降、品質(zhì)劣變、抗性減弱等現(xiàn)象，這些現(xiàn)象人們泛稱“退化”。 我國是食用菌生產(chǎn)大國，而食用菌菌種的退化又是一個較為常見的現(xiàn)象，因此國內(nèi)針對食用菌生產(chǎn)上的退化現(xiàn)象有較多的綜合性報道，內(nèi)容包括食用菌菌種退化與老化的現(xiàn)象，可能的因素及防止措施。其中提到退化因素可能有遺傳變異、病毒或雜菌污染、無限傳代、營養(yǎng)不良、保藏不當(dāng)、人工選擇偏差等內(nèi)外因[5～7]。但在食用菌的退化機理研究方面，除了本實驗室對雙孢蘑菇的叢生變異與基質(zhì)降解能力退化現(xiàn)象有關(guān)于基因變異的初步研究和公開報道[2，8，9]，以及Magae等[10]在金針菇和Qiu等[11]在平菇中發(fā)現(xiàn)dsRNA病毒感染可導(dǎo)致性狀退化外，未見其他食用菌退化的相關(guān)基因與分子機理研究的文獻(xiàn)報道。

我們的研究首次發(fā)現(xiàn)一些在雙孢蘑菇基質(zhì)降解能力退化菌株中差異表達(dá)的基因，但這些基因及其上游序列在三個菌株中未能發(fā)現(xiàn)可重復(fù)的實質(zhì)性差異。結(jié)合DDRT-PCR結(jié)果我們判斷正常與退化菌株的這些基因在轉(zhuǎn)錄上存在量的差異。但結(jié)構(gòu)基因本身及其上游調(diào)控序列并未發(fā)生實際的變異，退化更可能是影響胞內(nèi)信號傳導(dǎo)或基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控蛋白基因變異引起的。這為進一步深入研究雙孢蘑菇分解基質(zhì)能力退化的分子機理奠定了基礎(chǔ)。

［1]王澤生，廖劍華，陳美元.我國雙孢蘑菇育種研究與產(chǎn)業(yè)發(fā)展［J].食用菌學(xué)報，2010，（增刊）：19-20.

［2]陳美元，王澤生，廖劍華，等.雙孢蘑菇基質(zhì)降解能力退化的 DDRT-PCR分析［J].菌物學(xué)報，2010，29（5）：707-712.

［3]陳美元，廖劍華，盧政輝，等.雙孢蘑菇栽培菌株遺傳多樣性的DNA指紋分析［J].菌物學(xué)報，2007，26（增刊）：128-137.

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