吳彤華 朱元昌 尹 彪 李觀貴 陳文娜 陳春媚 曾 勇 梁佩燕 (深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 深圳中山生殖與遺傳研究所 深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518000)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrentmiscarriage，RM)是指臨床上連續(xù)3次或者3次以上妊娠終止于20周之前的自然流產(chǎn)，是一種常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥，發(fā)病率約為1% ～2%，病因十分復(fù)雜，除少數(shù)已知病因(如染色體核型異常、解剖結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌異常和TORCH感染因素等)外，大部分病因不明［1］，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Unexplained recurrentmiscarriage，uRM)，有越來(lái)越多的研究表明uRM的發(fā)生與母胎的免疫異常有關(guān)，母胎的免疫識(shí)別及免疫耐受被認(rèn)為是維持妊娠的關(guān)鍵［2，3］。HLA 主要是識(shí)別“自我”與“非我”的大分子物質(zhì)，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類分子，其中Ⅱ類分子尤其是HLA-DQ分子，與uRM之間的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)。DQ分子具有高度的多態(tài)性，uRM與DQ分子的關(guān)聯(lián)與人種特異性和區(qū)域分布有關(guān)［4］。當(dāng)前大多數(shù)的學(xué)者只是關(guān)注女方DQ位點(diǎn)的易感性與uRM的關(guān)系，研究很少考慮男方DQ位點(diǎn)的作用，而胚胎是夫婦雙方遺傳信息的重新組合，有一半的遺傳信息來(lái)自于男方，因而男方作用不應(yīng)被忽略。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用序列特異性引物 PCR(Sequence specific primer，SSP-PCR)和基因測(cè)序分型的方法(Sequence based typing，SBT)分析夫婦雙方HLA-DQA1和HLA-DQB1等位基因頻率和HLA的位點(diǎn)相容性，試圖從免疫遺傳角度探討uRM的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象

1．1．1 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組 2010年2月 ～2012年6月就診于深圳中山泌尿外科醫(yī)院復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與反復(fù)胚胎種植失敗診療中心25例不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦，年齡介于25～42歲，平均(32．77±4．71)歲，經(jīng)檢測(cè)符合以下標(biāo)準(zhǔn):夫婦雙方染色體核型正常，無(wú)家族遺傳性病史;經(jīng)婦科、B超及子宮輸卵管造影檢查，排除生殖器解剖結(jié)構(gòu)上畸形;內(nèi)分泌(FSH、LH、PRL、HCG)各項(xiàng)指標(biāo)正常，無(wú)糖尿病和甲狀腺功能亢進(jìn)或者其他內(nèi)分泌病史;無(wú)TORCH等病原體感染;自身抗體(抗磷脂抗體等)結(jié)果均為陰性。

1．1．2 對(duì)照組 與復(fù)發(fā)自然流產(chǎn)組同期就診行輔助生殖的16對(duì)夫婦，年齡介于26～40歲，平均(32.89±3．52)歲，女方各項(xiàng)檢查指標(biāo)均正常，不孕原因單純由男方少弱精引起，經(jīng)過(guò)卵胞內(nèi)單精子注射-胚胎移植(Intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，ICSI-ET)治療后，16對(duì)夫婦均正常妊娠，且無(wú)自然流產(chǎn)，死胎，死產(chǎn)等發(fā)生。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 DNA樣本的提取 EDTA-K2抗凝管采集夫婦雙方靜脈血2 ml，采用 Qiagen公司的 QIAamp DNA bloodmini kit提取全血DNA，DNA提取按照試劑盒說(shuō)明書操作，樣本DNA保存于－20℃冰箱。

1．2．2 HLA分型檢測(cè) 采用 Invitrogen公司的HLA-DQ High Res Kit試劑盒檢測(cè)HLA-DQ的分型，過(guò)程如下:①PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件按照試劑盒說(shuō)明書操作;②HLA-DQA1采用SSPPCR方法進(jìn)行分析;③HLA-DQB1采用SBT的方法進(jìn)行分析。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 夫婦雙方 HLA-DQA1、HLADQB1等位基因的頻率分布和匹配個(gè)數(shù)采用四格表χ2檢驗(yàn)公式進(jìn)行顯著性分析，計(jì)算各等位基因患病的相對(duì)危險(xiǎn)率(Odds risk，OR)，OR=1，與疾病發(fā)生不相關(guān);OR＞1，與疾病發(fā)生正相關(guān)，＞4時(shí)，表明與該種疾病強(qiáng)相關(guān);OR＜1，與疾病發(fā)生負(fù)相關(guān)，具有保護(hù)性作用。P＜0．05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上統(tǒng)計(jì)均采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果

2．1 夫婦雙方HLA-DQA1和HLA-DQB1基因型的分布 uRM組夫婦雙方HLA-DQA1各位點(diǎn)等位基因頻率與對(duì)照組相比(見(jiàn)表1)，DQA1*01:02的基因頻率(28.13%vs12.00%)在男方中明顯下降，而HLA-DQA1*03:02的基因頻率(12.50% vs 22.00%)在女方中明顯升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 uRM組與對(duì)照組夫婦雙方HLA-DQA1等位基因的頻率分布Tab．1 Frequency of HLA-DQA1 alleles in coup les with uRM and in controls

表2 uRM組與對(duì)照組夫婦雙方HLA-DQB1等位基因的頻率分布Tab．2 Frequency of HLA-DQB1 alleles in coup les with uRM and in controls

uRM組夫婦雙方HLA-DQB1等位基因的分布頻率與對(duì)照組相比(見(jiàn)表2)，在女方中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在男方中，HLA-DQB1*03:01 升高(12．50%vs 32.00%，χ2=4．02，OR=3．29，P=0．045)，HLADQB1*05:02 降低(21．88%vs 4．00%，χ2=6．38，OR=0.149，P=0．025)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．2 夫婦雙方HLA的相容性及HLA-DQB1第57位天冬氨酸的比較 uRM夫婦雙方HLA-DQ等位基因的匹配與對(duì)照組相比(見(jiàn)表3)，不同匹配個(gè)數(shù)之間有降低的趨勢(shì)，但差異尚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)對(duì)比夫婦雙方HLA-DQB1第57位非天門冬氨酸(DQB1*02:01、DQB1*03:02、DQB1*05:01/05:02、DQB1*06:04/DQB1*06:05)與天冬氨酸的頻率分布(見(jiàn)表4)，無(wú)論在男方中還是在女方中兩者間的差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(28．14% vs 32.00% ，P=0.81;21．25%vs 46．00%，P=0．25)。

3 討論

HLA復(fù)合體位于人類第6號(hào)染色體短臂上，長(zhǎng)約4 000 kb，由一組緊密連鎖的復(fù)等位基因組成，是迄今為止人類已知最復(fù)雜的基因系統(tǒng)，約占人類基因組的1/3 000，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)區(qū)域，其中Ⅱ區(qū)基因在提呈抗原方面的作用較為重要，可分為DP、DQ、DR三個(gè)亞區(qū)，完整的DQ分子由DQA1基因編碼的α鏈和DQB1基因編碼的β鏈組成，具有高度的多態(tài)性，在引發(fā)特定的免疫反應(yīng)中扮演重要的作用。當(dāng)前，HLA-DQ與uRM之間的關(guān)系也成為研究熱點(diǎn)，主要集中在HLA-DQ的易感基因、易感單元體和夫婦雙方HLA-DQ分子的相容性等方面，但由于HLA-DQ分子種類的有限性和等位基因的高度多態(tài)性，不同等位基因之間連鎖的不平衡，區(qū)域的多變性和人種的多樣性等因素的影響，不同學(xué)者報(bào)道的結(jié)果差異較大，因而他們之間的關(guān)系迄今還不是很明確。

uRM的發(fā)生主要是由于母體免疫異常，引起母體對(duì)胚胎的免疫排斥和殺傷，從而導(dǎo)致流產(chǎn)的產(chǎn)生。胚胎是夫婦雙方遺傳信息的重新組合，胚胎的遺傳信息一半來(lái)自于母方，另一半來(lái)自于父方，母體通過(guò)免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎進(jìn)行識(shí)別，妊娠的繼續(xù)取決于母體對(duì)胚胎同種半異體抗原的識(shí)別，以及是否能“免疫耐受”父方的抗原。正常妊娠過(guò)程中父方的HLA抗原可以有效的刺激母體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體和多種有利于妊娠的細(xì)胞因子，這些相應(yīng)抗體和細(xì)胞因子能有效的保護(hù)胚胎，避免母體對(duì)胚胎的攻擊，保護(hù)胚胎，維持妊娠的繼續(xù)。目前認(rèn)為HLA主要是通過(guò)以下兩種途徑導(dǎo)致uRM的發(fā)生［5］:第一:母體特異性HLA位點(diǎn)，即母體自身存在一些疾病易感基因位點(diǎn)或者連鎖單元體，導(dǎo)致母體對(duì)胚胎抗原反應(yīng)不足或過(guò)于強(qiáng)烈等不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng);第二:母胎雙方HLA-DQ抗原相容性增大，即母胎共享若干個(gè)共同抗原，胚胎與母體細(xì)胞表面抗原相似但又不完全相同，母體錯(cuò)將胚胎視為外來(lái)細(xì)胞或自身“異常或腫瘤細(xì)胞”而殺傷胚胎，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。以上觀點(diǎn)特別是第一種觀點(diǎn)更多考慮是女方的因素而沒(méi)有考慮男方因素的作用，而妊娠是一個(gè)雙方遺傳信息的重新組合，因而男方的作用也不可忽略。本實(shí)驗(yàn)將分別從雙方HLA-DQ等位基因易感性，夫婦雙方HLA-DQ位點(diǎn)的相容性以及DQB1第57位非天門冬氨酸的多態(tài)性等全面評(píng)估HLA-DQ與uRM之間的關(guān)系，進(jìn)一步明確HLA-DQ分子在uRM發(fā)生中的作用。目前這類文獻(xiàn)主要集中在對(duì)女方的研究而對(duì)男方的研究較少見(jiàn)報(bào)道。

關(guān)于母體HLA-DQA1位點(diǎn)的易感基因報(bào)道較少，Dasgupta等［4］報(bào)道在高加索人群中DQA1*01:01和DQA1*05:01在RM患者中顯著增高，本研究結(jié)果表明HLA-DQA1所有位點(diǎn)的基因頻率與正常對(duì)照組相比沒(méi)有顯著的差異，盡管DQA1*03:02的頻率在夫婦雙方中，尤其是在女方中有較為明顯的升高，但沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也揭示了HLA-DQA1分子在uRM易感性方面不確定起著顯著的作用。

在HLA-DQ分子中，與RM的研究更多集中在DQB分子中，認(rèn)為DQB在uRM發(fā)病中具有更加重要的作用，有大量文獻(xiàn)報(bào)道HLA-DQB1分子與uRM之間的相關(guān)性，例如DQB1*02:01、DQB1*03:03、DQB1*06:01、DQB1*06:04/DQB1*06:05 等［6-9］頻率在uRM患者中明顯升高，DQA1*02:01-DQB1*02:01、DQA1*01:01-DQB1*05:01、DQA1*05:01-DQB1*02:01單元型與uRM相關(guān)。本研究結(jié)果表明HLA-DQB1*03:01在夫婦中出現(xiàn)頻率都明顯升高，且在丈夫中達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，揭示DQB1*03:01可能是導(dǎo)致uRM發(fā)生的易感基因。

Deschamps［10］在 Ⅰ 型糖尿病的研究中證實(shí)，HLA-DQB1β鏈第57位天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)若被其他氨基酸取代(丙氨酸、纈氨酸等)，則會(huì)影響與α鏈第76位或第79位堿性氨基酸的結(jié)合，引起HLA-DQB1空間結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。為了了解β鏈第57位非Asp在uRM中的作用，本研究將uRM患者夫婦DQBβ鏈第57位Asp與非 Asp(DQB1*02:01、DQB1*03:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*05:02等)基因頻率與對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)果在uRM夫婦中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)β鏈第57位非Asp頻率增高，本研究結(jié)果提示HLA-DQB1β鏈第57位總的非Asp的基因型與uRM的發(fā)生沒(méi)有顯著的相關(guān)性，雖然有少數(shù)學(xué)者報(bào)道有一種或少數(shù)幾種非Asp基因型與uRM的發(fā)生相關(guān)，而大多數(shù)研究認(rèn)為非Asp基因型與uRM的發(fā)生并沒(méi)有顯著的相關(guān)性，甚至個(gè)別等位基因是保護(hù)性基因，如本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示HLA-DQB1*05:02可能是一種保護(hù)性基因，與林其徳［11］報(bào)道的研究結(jié)果一致。

夫婦雙方的HLA-DQ位點(diǎn)的相容性一直是關(guān)注的焦點(diǎn)，有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，夫婦雙方HLA的相容性增加會(huì)導(dǎo)致母體的免疫異常，產(chǎn)生一系列的妊娠并發(fā)癥如先兆子癇、RM等［12］，針對(duì)于雙方存在共同的HLA-DQ位點(diǎn)的夫婦進(jìn)行丈夫淋巴細(xì)胞皮下注射，取得一定的臨床治療效果［13］;但也有不少學(xué)者提出質(zhì)疑，認(rèn)為兩者之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性，即兩者的相容性增加或者降低與uRM的發(fā)生沒(méi)有必然的因果關(guān)系［14，15］。本實(shí)驗(yàn)中uRM夫婦雙方HLADQ的相容性比例僅為32%，低于對(duì)照組的68.75%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持HLA-DQ的相容性與uRM發(fā)生之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性。

綜上，HLA-DQ分子在uRM的發(fā)生中扮演著重要的作用，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)與uRM發(fā)生相關(guān)的等位基因，同時(shí)揭示夫婦雙方HLA位點(diǎn)的相容性與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性，但實(shí)驗(yàn)樣本量較小，需要后續(xù)進(jìn)一步加大實(shí)驗(yàn)樣本量進(jìn)行證實(shí)，為臨床檢查提供更可靠的檢測(cè)指標(biāo)。

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