尉明曉,秦 超,陳 威,高 潔,趙顯莉,高 虹
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,北京 100021)
代謝綜合癥(表現(xiàn)為高血壓、內(nèi)臟肥胖、胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝異常)的治療是目前醫(yī)學(xué)界面臨的一大難題。過氧化物酶體增殖激活受體 α(peroxisome proliferators-activated receptor α,PPARα),參與調(diào)控脂質(zhì)代謝和免疫反應(yīng)等生理過程,能夠改善代謝綜合征的狀況。因此,近年來,臨床上的PPARα激動劑藥物常被用來進(jìn)行降血脂的治療。使用PPARα轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行PPARα激動劑藥物的臨床前評價,建立一種藥效學(xué)敏感的動物模型,用于該類藥物的早期篩選,為藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)節(jié)約時間和經(jīng)費,為人類的臨床用藥提供理論依據(jù)。本課題著重探討利用 PPARα轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行PPARα激動劑藥物的藥效學(xué)評價的可行性。
PPARα轉(zhuǎn)基因小鼠,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所遺傳中心構(gòu)建,6月齡的C57BL/6小鼠,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,合格證號 SCXK(京)2012-0001。36只小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中,動物設(shè)施許可證號 SYXK(京)2008-0012。飼喂的高脂飼料購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心,飼料配方為:豬油10%,蔗糖15%,膽固醇1%,蛋黃粉10%,膽酸鈉0.1%,基礎(chǔ)鼠料63.9%,飼料合格證:SCXK(軍)-2007-005。
非諾貝特藥物由北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。7100型全自動生化分析儀,日本日立公司產(chǎn)品。
實驗小鼠總共分為4組。27只PPARα轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分成3組,每組9只,分別為對照組1、高劑量組(非諾貝特60 mg/kg)、低劑量組(非諾貝特30 mg/kg)。人每天用藥物非諾貝特劑量為0.3 g,按照“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”,20 g小鼠和70 kg人的交叉匯合處為0.0026,按人的平均體重70 kg計算,小鼠的折合劑量為0.3 g/70 kg×70 kg×0.0026/20 g=39 mg/kg。選取 60 mg/kg作為高劑量,30 mg/kg作為低劑量組,同時設(shè)置9只C57BL/6小鼠作為對照組2。每只動物灌胃體積為0.2 mL/10 g體重。各種小鼠在同等的SPF級環(huán)境下飼養(yǎng),自由攝食、飲水。各組動物分別在6周齡時給予高脂飼料喂養(yǎng)一個月,然后連續(xù)非諾貝特灌胃一個月。分別于給藥前后檢測動物的肝功能指標(biāo)、腎功能指標(biāo)和血脂生化指標(biāo)(表1)。
表1 實驗小鼠分組及給藥方法Tab.1 The medication method and group of laboratory mouse
1.4.1 大體觀察
每天觀察一次,觀察指標(biāo)包括小鼠外觀和行為(包括小鼠的皮膚毛發(fā),眼和黏膜的變化,呼吸,中樞神經(jīng)系統(tǒng),四肢活動及其他表現(xiàn))、分泌物和排泄物等。每周測定小鼠體重。
1.4.2 血生化指標(biāo)的檢測
4組實驗小鼠在非諾貝特灌胃前、灌胃結(jié)束后眼眶靜脈叢取血,留取血清檢測血液生化指標(biāo)。肝臟功能的指標(biāo)包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)。腎臟功能的指標(biāo)包括血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCR)。血脂生化的指標(biāo)包括膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、游離脂肪酸(NEFA)。
采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以表示,P<0.05為差異具有顯著性,P<0.01為差異非常具有顯著性,P<0.001為差異極其具有顯著性。統(tǒng)計學(xué)方法為t檢驗,方差分析,非參數(shù)檢驗。
整個實驗過程中小鼠的皮膚正常無脫毛現(xiàn)象,眼睛與黏膜無異常分泌物,呼吸平穩(wěn),活動正常,無抽搐震顫等異?,F(xiàn)象發(fā)生。動物給藥后體重變化不大,各組之間的體重沒有明顯差異(P>0.05)(表2)。
動物開始給藥前,各組之間的10項血生化指標(biāo)沒有顯著性差異(P>0.05)(表3)。①給藥后各組比較:從圖1可以看出,與對照組1比較,非諾貝特各劑量組均能明顯升高CHO(P<0.05)和HDL-C(P<0.01),明顯降低 TG(P<0.05)。各組之間的體重沒有明顯差異(P>0.05)。與對照組2比較,非諾貝特各劑量組均能顯著升高 HDL-C(P<0.01),顯著降低 TG(P<0.01),提示 PPARα轉(zhuǎn)基因小鼠對該藥物更敏感。②給藥前后各組比較:從圖1可以看出,與給藥前比較,給藥后高劑量組能明顯降低 ALT、AST、ALP、BUN、TG(P < 0.05);能明顯升高CHO、HDL-C(P<0.01)。而低劑量組能明顯降低ALP(P<0.05);能明顯升高 CHO、HDL-C(P<0.05),但腎功能指標(biāo)在正常范圍內(nèi),沒有臨床意義。結(jié)果提示高劑量組的降血脂效果優(yōu)于低劑量組。給藥前后的血生化指標(biāo)(表3)。
表2 給藥后小鼠體重變化Tab.2 Change of mouse weight with the medication administration
表3 給藥前后的血生化指標(biāo)變化Tab.3 Change of serum index with the medication administration
圖1 給藥前后血生化的變化。Fig.1 Change of serum index(ALT、AST、ALP、CHO、TG、HDL-C)with the medication administration.
PPARα受體是今年來新發(fā)現(xiàn)的一種甾體激素類受體,作為PPARα受體的一個亞型,在脂質(zhì)代謝、炎癥過程、免疫反應(yīng)等生理過程中發(fā)揮著巨大的作用。PPARα主要分布在代謝活性較高的組織中,如腎、肝、心臟、肌肉組織[1]。PPARα 在肝臟脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著巨大的作用。PPARα激動劑圍繞降血脂這一中心功能與臨床上許多疾病有關(guān),比如改善脂質(zhì)代謝、動脈粥樣硬化、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮等作用[2-10]。
代謝綜合癥表現(xiàn)為高血壓、內(nèi)臟肥胖、胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝異常,它的治療是醫(yī)學(xué)界面臨的一大難題。PPARα基因參與調(diào)控脂質(zhì)代謝和免疫反應(yīng)等生理過程,能夠改善代謝綜合癥的癥狀[11]。
轉(zhuǎn)基因動物具有與人類相似的疾病致病原因、機(jī)制的優(yōu)點,使用其評價的藥物,其結(jié)果更加準(zhǔn)確。轉(zhuǎn)基因動物已在抗腫瘤藥物、抗艾滋病藥物、抗肝炎病毒藥物、腎臟疾病藥物的篩選中取得了突破性的進(jìn)展[12]。本課題著重利用PPARα轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行PPARα激動劑藥物的藥效學(xué)評價。
有文獻(xiàn)報道[13-14],PPARα 激動劑降低甘油三酯的水平,升高高密度脂蛋白膽固醇成分,能夠誘導(dǎo)膽固醇從巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞里移出。在導(dǎo)致低血糖的長時間的禁食下,脂肪酸從脂肪沉積的部位游走到肝臟,在肝臟它們被攝取,氧化和代謝成酮體,PPARα在這代謝過程中能起到中樞性的作用[15]。本文的實驗結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致,脂肪酸的下降不明顯可能與灌胃時間為一個月有關(guān),延長灌胃時間可能會出現(xiàn)脂肪酸的下降。關(guān)于脂肪酸的下降方面的研究值得我們進(jìn)一步探討。
與給藥前比較,給藥后高劑量組和低劑量組能明顯升高 CHO、HDL-C,能明顯降低肝功能指標(biāo)。臨床上高血脂常伴有輕到重度的脂肪肝,引起肝功能指標(biāo)的上升,PPARα激動劑能夠顯著改善脂肪肝的狀況[10],在本實驗中給藥后高劑量組能明顯降低ALT、AST、ALP,與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。在 PPARα 轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi),非諾貝特給藥一個月能改善肝臟功能及降血脂作用。
根據(jù)本試驗結(jié)果提示,PPARα轉(zhuǎn)基因小鼠與C57BL/6相比,在評價PPARα激動劑藥效學(xué)方面比常規(guī)C57BL/6小鼠更敏感,是一個新的、敏感的動物模型。
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