馬璟曦，羅勇，蔡敏

腦缺血損傷修復(fù)再生過(guò)程存在著兩個(gè)不同方面：神經(jīng)發(fā)生和血管生成。它們?cè)谌毖笸瑫r(shí)被啟動(dòng)，并被精密、協(xié)調(diào)、統(tǒng)一地調(diào)控。腦缺血后“神經(jīng)發(fā)生-血管生成”之間可能存在密切聯(lián)系和相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)或血管產(chǎn)生的神經(jīng)血管因子[1]如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)等在神經(jīng)發(fā)生和血管生成過(guò)程中相互作用，在腦缺血后協(xié)調(diào)地表達(dá)。在本課題組原有研究基礎(chǔ)上[2]，本研究進(jìn)一步探究電針干預(yù)后大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-de-rived neurotrophic factor,BDNF)的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

健康成年雄性Wistar大鼠90只，體重250～300 g。由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(渝)20020002。

隨機(jī)分為對(duì)照組(n=6)、模型組(局灶性腦缺血再灌注，n=42)、電針組(局灶性腦缺血再灌注+電針，n=42)。后兩組局灶性腦缺血1 h后分別于2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d共7個(gè)時(shí)相點(diǎn)再灌注，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只。

1.2 模型制備

模型組和電針組采用線栓法制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型。3.5%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉，大鼠仰臥位固定，經(jīng)頸部正中切口依次暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈顱外段。在頸外動(dòng)脈殘端做一環(huán)形切口，將預(yù)先處理的栓子向頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)方向插入17～20 mm，如遇阻力，表明線栓頭部已通過(guò)大腦中動(dòng)脈起始部，停止進(jìn)線，結(jié)扎。1 h后拔回線栓至頸外動(dòng)脈的殘端，實(shí)現(xiàn)再灌注。模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：①左側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或不出現(xiàn)；②行走時(shí)向左側(cè)偏倒或原地向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；③提尾倒懸時(shí)左上肢不向前下伸；④右側(cè)出現(xiàn)Honer征。

1.3 電針刺激方法及參數(shù)

對(duì)照組和模型組不做特殊處理。電針組參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜，選取雙側(cè)合谷穴(LI 4)為電針穴位。局灶性腦缺血后45 min，電針刺激上述穴位，15 min/次。刺激參數(shù)：疏密波F1=40 Hz，F(xiàn)2=60 Hz，空載輸出電壓1.5 V。對(duì)超過(guò)1 d的時(shí)相點(diǎn)，每日電針1次，7 d后自然喂養(yǎng)，不做特殊處理。

1.4 VEGFR-2 mRNA檢測(cè)

本課題組前期研究提示，電針組和模型組與對(duì)照組比較，VEGF mRNA表達(dá)在12 h增加，24 h達(dá)高峰，3 d后開始下降[2]。本實(shí)驗(yàn)采用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)VEGFR-2 mRNA，選擇12 h、24 h、3 d三個(gè)代表時(shí)間點(diǎn)來(lái)研究。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，VEGFR-2 mRNA序列號(hào)X13412。①擴(kuò)增大鼠VEGFR-2 mRNA上游引物序列：5'-CAAAGCAAGTCA TCA CCAAG-3'，下游引物序列：5'-AAG CCA GAA GAT GAA TACACT C-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為557 bp；②擴(kuò)增大鼠β-actin mRNA(內(nèi)參照)上游引物序列：5'-GAC TAC CTC ATG AAG ATC CT-3'，下游引物序列：5'-GCG GAT GTC CAC GTCACA CT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為313 bp。無(wú)酶條件下準(zhǔn)確稱取100 mg缺血腦組織，采用Trizol提取試劑盒(Invitrogen公司)提取RNA。并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。取1μl RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，35個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)，再制膠、上樣、電泳，觀察結(jié)果，運(yùn)用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.5 取材

各時(shí)間點(diǎn)大鼠麻醉后用生理鹽水200 ml快速左心室灌注沖洗，再用4%多聚甲醛(pH 7.4的0.1 M PBS配置，加0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)500 ml先快后慢灌注固定，斷頭取腦，制備石蠟切片。取相鄰的切片用于免疫組化。

1.6 BDNF免疫組化檢測(cè)

切片脫蠟至水，抗原熱修復(fù)92～98℃15 min，滴加封閉液，滴加1∶100兔多克隆BDNF抗體(Santa Cruz公司)4℃過(guò)夜，滴加SABC。DAB顯色、脫水、透明、封片。

1.7 結(jié)果判定

VEGFR-2 mRNA RT-PCR結(jié)果判定：將電泳結(jié)果用Quantity One 4.3.1系統(tǒng)掃描，測(cè)定各條帶絕對(duì)積分光密度(optical density,OD)值，結(jié)果以mRNA相對(duì)值表示。

BDNF免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：在400倍視野下計(jì)數(shù)，以胞漿染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。每只動(dòng)物隨機(jī)選取3張非連續(xù)切片，每張切片取10個(gè)不連續(xù)視野的均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組數(shù)據(jù)用(±s)表示，用SPSS 12.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 VEGFR-2 mRNA RT-PCR結(jié)果

模型組VEGFR-2 mRNA相對(duì)值從再灌注后12 h到3 d均較對(duì)照組顯著增加(P<0.001)，再灌注后24 h達(dá)到高峰，這和本課題組既往報(bào)道的VEGF mRNA[2]表達(dá)高峰基本吻合。再灌注后3 d開始下降，但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。電針組VEGFR-2 mRNA相對(duì)值從再灌注后12 h到3 d均較對(duì)照組顯著增加(P<0.001)，再灌注后24 h達(dá)到高峰。電針組再灌注后12h、24 h VEGFR-2 mRNA明顯高于模型組(P<0.01)，電針組再灌注后3 d也高于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組VEGFR-2 mRNA的表達(dá)(mRNA相對(duì)值)

2.2 BDNF蛋白免疫組化

對(duì)照組：見(jiàn)少量BDNF蛋白表達(dá)，著色較淡，分布于大腦皮質(zhì)及海馬等部位。

模型組：與對(duì)照組比較，海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)在再灌注后2 h增加(P<0.05)，12 h繼續(xù)增加(P<0.001)，再灌注后24 h達(dá)高峰(P<0.001)，14 d仍高于對(duì)照組(P<0.001)。見(jiàn)圖1、表2。

電針組：與對(duì)照組比較，海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)在再灌注后2 h開始顯著增加(P<0.001)，24 h達(dá)高峰(P<0.001)，直到14 d仍有顯著性差異(P<0.05)；與模型組比較，海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)在再灌注后2 h開始增加(P<0.05)，再灌注后24 h達(dá)高峰(P<0.01)，3 d后增加仍有顯著性差異(P<0.05)，但呈現(xiàn)增加幅度降低的趨勢(shì)。細(xì)胞漿染成棕黃色，強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞主要在缺血半球，尤其是病灶周圍，在血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元都有表達(dá)，分布范圍廣泛。見(jiàn)圖2、表2。

圖1 模型組海馬BDNF蛋白再灌注24 h時(shí)的表達(dá)(400×)

圖2 電針組海馬BDNF蛋白再灌注24 h時(shí)的表達(dá)(400×)

表2 各組BDNF蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

3 討論

3.1 神經(jīng)血管單元[4]和神經(jīng)血管因子

卒中后神經(jīng)修復(fù)再生過(guò)程包括神經(jīng)發(fā)生、血管新生以及突觸發(fā)生和軸突生長(zhǎng)[5]。神經(jīng)干細(xì)胞的小生境(niche)中的血管微環(huán)境對(duì)神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)起至關(guān)重要的作用[6]。既往缺血性腦血管病的研究較注重神經(jīng)細(xì)胞，而對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)注相對(duì)不夠。腦缺血后神經(jīng)和血管的相互聯(lián)系作用是現(xiàn)在腦卒中研究的熱點(diǎn)之一。神經(jīng)血管單元[4]由神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞-血管構(gòu)成，包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小角質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管周細(xì)胞、基底膜以及細(xì)胞外基質(zhì)。這個(gè)概念強(qiáng)調(diào)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用和動(dòng)態(tài)平衡，以動(dòng)態(tài)的觀點(diǎn)全面反映缺血后的病理生理過(guò)程，為治療缺血性腦血管病開拓了新的視野。

神經(jīng)血管因子[1]和神經(jīng)血管單元有著十分密切的關(guān)系。既往實(shí)驗(yàn)表明，一些經(jīng)典的血管生長(zhǎng)因子，如VEGF[7]、血管生成素[8]等，也具有刺激神經(jīng)發(fā)生或神經(jīng)保護(hù)的作用。而一些傳統(tǒng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如BDNF[9]等，也具有增加血管新生或引導(dǎo)血管出芽等作用。這些作用于神經(jīng)和血管的生長(zhǎng)因子統(tǒng)稱為神經(jīng)血管因子。對(duì)神經(jīng)血管因子的研究可以深化對(duì)神經(jīng)血管單元的認(rèn)識(shí)。神經(jīng)血管因子為神經(jīng)發(fā)生與血管生成的聯(lián)系及作用提供了可能的分子學(xué)基礎(chǔ)。因此，重新認(rèn)識(shí)VEGF、血管生成素、BDNF等神經(jīng)血管因子在腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)中的作用十分必要。

3.2 腦缺血和神經(jīng)血管因子

研究腦缺血后VEGF、BDNF作用的文獻(xiàn)報(bào)道很多，但是從神經(jīng)血管因子這一新的角度切入更能深入、系統(tǒng)、全面地了解這些因子在腦缺血后修復(fù)再生中的作用。在缺血性腦血管病的臨床治療中把神經(jīng)發(fā)生和血管生成結(jié)合起來(lái)，促進(jìn)神經(jīng)血管單元的協(xié)調(diào)和優(yōu)化，是今后努力的方向。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)局灶性腦缺血再灌注后VEGF、血管生成素-1的表達(dá)增加[2]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血再灌注后VEGFR-2、BDNF不僅在缺血半暗帶表達(dá)，而且在遠(yuǎn)離缺血區(qū)的側(cè)腦室、海馬、紋狀體等部位表達(dá)；不僅在神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，而且在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。這些結(jié)果初步提示，神經(jīng)血管因子表達(dá)部位廣泛，其可能的作用途徑和機(jī)制也是多種的。

研究表明，VEGF/VEGFR系統(tǒng)[10]可能在血管新生的早期發(fā)揮關(guān)鍵性作用，是整個(gè)腦缺血后血管新生調(diào)控的中心環(huán)節(jié)。VEGFR-2是內(nèi)皮細(xì)胞上VEGF的主要受體類型。VEGF通過(guò)VEGFR-2發(fā)揮強(qiáng)大的血管效應(yīng)，包括增加微血管通透性，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生、入侵、遷移、存活等多個(gè)方面[11]。VEGF刺激神經(jīng)發(fā)生的可能機(jī)制是[12]：①VEGF通過(guò)促進(jìn)血管小生境的建立刺激神經(jīng)前體細(xì)胞的增生和分化；②VEGF通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的特異性信號(hào)，如BDNF；③VEGF作為一個(gè)直接的促有絲分裂原引起神經(jīng)前體細(xì)胞增生。腦缺血后神經(jīng)母細(xì)胞表達(dá)VEGFR-2，并沿血管遷移。VEGFR-2介導(dǎo)的信號(hào)通路在促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)血管重塑及其聯(lián)系神經(jīng)發(fā)生和血管生成中起關(guān)鍵作用[13]。本課題組發(fā)現(xiàn)局灶性腦缺血再灌注后VEGF/VEGFR-2表達(dá)均增加。本實(shí)驗(yàn)觀察到VEGFR-2 mRNA相對(duì)值從再灌注后12 h到3 d均較對(duì)照組顯著增加，再灌注后24 h達(dá)到高峰。提示局灶性腦缺血再灌注后VEGF/VEGFR-2表達(dá)增加可能有助于神經(jīng)血管單元的重建。

BDNF可以在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，并通過(guò)旁分泌和自分泌作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血管[14]。BDNF增加錳超氧化物歧化酶(MnSOD)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力[15]，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活和誘導(dǎo)缺血組織的血管生成[16]。本實(shí)驗(yàn)觀察到BDNF蛋白表達(dá)在再灌注后2 h明顯增加，24 h達(dá)高峰，14 d仍較對(duì)照組有顯著性差異。提示神經(jīng)血管因子BDNF在腦缺血后表達(dá)增加可能有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)和血管生成。

3.3 電針和神經(jīng)血管因子

既往研究表明，電針結(jié)合經(jīng)顱磁刺激[17]和電針[18]可以促進(jìn)腦缺血大鼠BDNF及mRNA表達(dá)。電針增加大鼠腦缺血再灌注后骨髓及外周血中VEGF濃度，VEGF作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)表面的VEGFR-2，加速EPCs動(dòng)員和遷移[19]。

本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，電針合谷穴可能通過(guò)上調(diào)血管生長(zhǎng)因子VEGF、血管生成素-1和下調(diào)血管抑制因子的表達(dá)[2]，上調(diào)胎盤生長(zhǎng)因子及其受體Flt-1的表達(dá)[20]來(lái)促進(jìn)局灶性腦缺血再灌注后的血管新生；上調(diào)基質(zhì)衍生因子(SDF)-1α的表達(dá)來(lái)促進(jìn)局灶性腦缺血再灌注大鼠外周血EPCs、趨化因子受體4+(CXCR4+)細(xì)胞和骨髓EPCs數(shù)量增加[21]；并通過(guò)上調(diào)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)來(lái)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移[22]。提示電針對(duì)“神經(jīng)血管單元”具有“整體的良性調(diào)節(jié)”作用。電針能有效治療缺血性腦血管病可能與“整體調(diào)節(jié)”神經(jīng)血管因子的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到，電針刺激VEGFR-2 mRNA、BDNF蛋白表達(dá)較模型組更加明顯。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)電針對(duì)整個(gè)VEGF/VEGFR系統(tǒng)都有明顯激活作用。電針對(duì)腦缺血可發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多水平、多層次、多途徑的調(diào)節(jié)作用，有利于全面促進(jìn)整個(gè)腦缺血后的血管新生和神經(jīng)功能恢復(fù)。

目前仍有一些問(wèn)題值得進(jìn)一步的探索研究，如電針對(duì)神經(jīng)血管單元的整體作用起決定性作用的因素；電針對(duì)各種神經(jīng)血管因子表達(dá)的時(shí)空變化影響及它們的相互作用；它們對(duì)神經(jīng)血管單元的各種組成成分的作用。另一個(gè)值得關(guān)注的現(xiàn)象是，本實(shí)驗(yàn)電針刺激最多只有7 d，但7 d以后，甚至再灌注后21 d后神經(jīng)血管因子BDNF的表達(dá)仍高于模型組，提示電針治療效果持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，作用更持久。而既往實(shí)驗(yàn)對(duì)停止電針刺激后的血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)情況關(guān)注較少。還需要進(jìn)一步觀察和研究。

[1]Park JA,Choi KS,Kim SY,et al.Coordinated interaction of the vascular and nervous systems:from molecule-to cell-based approaches[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,311(2):247-253.

[2]馬璟曦,羅勇.電針對(duì)大鼠局灶腦缺血再灌注后腦內(nèi)血管生長(zhǎng)因子和血管抑制因子表達(dá)的影響[J].中國(guó)針灸,2007,27(2):129-133.

[3]羅勇,董為偉.Wistar大鼠插線法局灶腦缺血/再灌注模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,27(1):1-4.

[4]Lo EH,Dalkara T,Moskowitz MA.Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nat Rev Neurosci,2003,4(5):399-415.

[5]Beck H,Plate KH.Angiogenesisafter cerebral ischemia[J].Acta Neuropathol,2009,117(5):481-496.

[6]Yang XT,Bi YY,Feng DF.From the vascular microenvironment to neurogenesis[J].Brain Res Bull,2011,84(1):1-7.

[7]Sun J,Sha B,Zhou W,et al.VEGF-mediated angiogenesis stimulates neural stem cell proliferation and differentiation in the premature brain[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,394(1):146-152.

[8]Marteau L,Pacary E,Valable S,et al.Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon[J].Cereb Cortex,2011,21(7):1695-1702.

[9]Matsuda S,Fujita T,Kajiya M,et al.Brain-derived neurotrophic factor induces migration of endothelial cells through a TrkB-ERK-integrin αVβ3-FAK cascade[J].J Cell Physiol,2012,227(5):2123-2139.

[10]Harrigan MR.Angiogenic factors in the central nervous system[J].Neurosurgery,2003,53(3):639-660.

[11]Hicklin DJ,Ellis LM.Role of the vascular endothelial growth factor pathway in tumor growth and angiogenesis[J].J Clin Oncol,2005,23(5):1011-1027.

[12]Sun Y,Jin K,Xie L,et al.VEGF-induced neuroprotection,neurogenesis,and angiogenesis after focal cerebral ischemia[J].JClin Invest,2003,111(12):1843-1851.

[13]Li WL,Fraser JL,Yu SP,et al.The role of VEGF/VEGFR2 signaling in peripheral stimulation-induced cerebral neurovascular regeneration after ischemic stroke in mice[J].Exp Brain Res,2011,214(4):503-513.

[14]Kim H,Li Q,Hempstead BL,et al.Paracrine and autocrine functions of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)and nerve growth factor(NGF)in brain-derived endothelial cells[J].JBiol Chem,2004,279(32):33538-33546.

[15]He T,Katusic ZS.Brain-derived neurotrophic factor increases expression of MnSOD in human circulating angiogenic cells[J].Microvasc Res,2012,83(3):366-371.

[16]Kermani P,Hempstead B.Brain-derived neurotrophic factor:a newly described mediator of angiogenesis[J].Trends Cardiovasc Med,2007,17(4):140-143.

[17]彭力,黃曉琳,韓肖華.電針結(jié)合經(jīng)顱磁刺激對(duì)腦缺血大鼠不同腦區(qū)NGF、BDNF及mRNA的表達(dá)[J].中國(guó)康復(fù),2009,24(6):363-366.

[18]李嫚,王夢(mèng),梅元武,等.不同時(shí)間窗電針治療對(duì)腦梗死大鼠Bcl-2和BDNF表達(dá)的影響[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2009,26(5):603-605.

[19]張彤,林濤,王秀志,等.電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注大鼠脊髓和血漿中EPCs及VEGF的影響[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2009,24(5):428-432.

[20]武磊,羅勇,張珊珊.電針對(duì)局灶腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)胎盤生長(zhǎng)因子及其受體Flt-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響及其促進(jìn)腦內(nèi)血管再生的作用[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2010,18(8):589-593.

[21]孫宏毅,羅勇,盧桃利,等.電針對(duì)局灶腦缺血/再灌注大鼠外周血和骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用[J].針刺研究,2012,37(3):179-185.

[22]趙振強(qiáng),羅勇.電針對(duì)大鼠局灶腦缺血/再灌注后神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2006,26(S1):20-24.