呂 盈，吳嬌嬌，付立忠，程俊文，張紅玉,3，李海波，魏海龍，許修宏

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院 浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；3.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050016）

雜種優(yōu)勢現(xiàn)象實際上是親本基因系統(tǒng)在雜合子內(nèi)相互作用的結(jié)果，是雜合子內(nèi)基因表達調(diào)控的外在表現(xiàn)形式。近年來，通過分子手段探討雜種與親本基因表達差異已在農(nóng)作物[1～7]、蔬菜[8]、林木[9]、畜禽[10～12]等領(lǐng)域廣泛展開，并取得了一些重要結(jié)論。如，玉米雜種優(yōu)勢的形成不僅與基因的表達與否相關(guān)，還與大量基因的上調(diào)或下調(diào)表達相關(guān)[4]。小麥穗下節(jié)間及株高雜種優(yōu)勢的形成可能與雜交種和親本的穗下節(jié)間大量涉及細胞分裂、膨大和物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程的基因的差異表達有關(guān)[3]?？瓜x雜交棉盛花期葉片中的基因顯性表達和雜種特異表達則有利于產(chǎn)量形成和雜種優(yōu)勢發(fā)揮[6]。然而，有關(guān)基因差異表達模式與食用菌雜種優(yōu)勢的相關(guān)性研究目前還較為少見。

差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（DDRT-PCR）是在基因轉(zhuǎn)錄水平上研究雜種優(yōu)勢遺傳機理的一種有效方法[13]。本研究選用慶科20、Cr02、申香9號、武香1號4個香菇菌株，通過原生質(zhì)體單核體制備、單核體交配型測定、雜交組合配制，采用mRNA差異顯示技術(shù)，分別檢測了3個香菇雜交組合的17個雜交子與4個香菇親本菌株在菌絲體培養(yǎng)階段mRNA差異表達，分析了差異表達模式與液體振蕩培養(yǎng)菌絲胞內(nèi)總糖含量的相關(guān)關(guān)系，旨在從轉(zhuǎn)錄水平上揭示出一些與香菇液體發(fā)酵菌絲胞內(nèi)總糖含量雜種優(yōu)勢形成有關(guān)的分子信息，為揭示香菇雜種優(yōu)勢形成過程中的一些重要現(xiàn)象和探索雜種優(yōu)勢的遺傳機理提供更多的資料。

1 材料和方法

1.1 供試材料

香菇親本菌株慶科20、申香9號、武香1號、Cr02由浙江省林業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所保藏。

1.2 方法

1.2.1 雜交子獲得 供試親本菌株原生質(zhì)體單核體制備、單核原生質(zhì)體雜交參照文獻[14]。

表1 引物編號和序列Table1 Code and sequences of prime

1.2.2 引物 所用引物由上海生工合成，引物編號和序列見表1。

1.2.3 RNA的提取 親本和雜交子菌株菌絲培養(yǎng)參照參考文獻[15]，總RNA提取采用TRIZOL法，具體參照產(chǎn)品說明書，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄、DDRT-PCR反應(yīng)及差異顯示 參照BioRT逆轉(zhuǎn)錄擴增試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，具體參照說明書，取RNA0.2 μg，用3條錨定引物（B0327-B0329）逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈。用10條隨機引物（表1）和3條錨定引物進行DDRT-PCR擴增，反應(yīng)體系為：10×Buffer 2.5 μL，1.5mMMgCl2，200 μM錨定引物，0.5 μM隨機引物，Taq酶 1U。反應(yīng)程序：94℃ 5 min，94℃ 30 s，40℃ 2 min，72℃ 1 min，40個循環(huán)，72℃ 5 min。取5 μL擴增產(chǎn)物，經(jīng)非變性8%聚丙烯酰胺凝膠（30%丙稀酰胺26.6 mL，10X TBE10.0 mL，水61.3 mL，3%過硫酸銨2.1 mL，Temed 134 μL）電泳恒功率70 w，電泳2 h后銀染。

1.2.5 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計分子量在100 ～ 1 400 bp的條帶，擴增條帶存在時賦值為1，沒有條帶則賦值為0。為增加試驗的可靠性，實驗中對每個引物組合均PCR擴增2次，僅統(tǒng)計穩(wěn)定擴增的條帶。將每種差異表達帶型的數(shù)量作為變量，與所有雜交子液體發(fā)酵菌絲胞內(nèi)總糖含量性狀表現(xiàn)和超親優(yōu)勢進行相關(guān)性分析。相關(guān)分析采用SPSS軟件。

液體發(fā)酵菌絲體胞內(nèi)多糖含量測定采用苯酚—硫酸法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇差異顯示圖譜及表達模式的統(tǒng)計結(jié)果

重復(fù)性好，條帶清晰的10個引物對共擴增出16 993個條帶，其中有6 017條表現(xiàn)出多態(tài)性，差異表達比例為35.41%。雜交子和親本間差異表達的條帶可概括為4種類型（圖1）：雙親共沉默類型（110、W1），即該條帶在雙親都有，而雜交子中沒有；（2）單親表達沉默類型（100＋010、W2），即該條帶僅出現(xiàn)在親本之一，而在另一親本和雜交子中沒有出現(xiàn)；（3）雜交子特異表達類型（001、W3），即該條帶僅在雜交子中出現(xiàn)，而在雙親中均不出現(xiàn)；（4）單親表達一致類型（101＋011、W4），即該條帶在雙親之一和雜交子中出現(xiàn)，而在另一親本中不出現(xiàn)。這些不同的差異表達類型在不同雜交子之間存在明顯差異（表2）。不同雜交子各種差異帶型所占比例不同，但均以W4為最高，W1和W3最少。W1平均為5.30%，W2為10.15%，W3為7.88%，W4為12.05%。

圖1 香菇雜交子與親本間基因差異表達類型Figure1 Patterns of gene expression between hybrids and their parents

2.2 基因差異表達模式與雜交子胞內(nèi)總糖含量、超親優(yōu)勢的相關(guān)分析

4種基因差異表達模式（表2）與雜交子液體發(fā)酵菌絲胞內(nèi)總糖含量、胞內(nèi)總糖含量超親優(yōu)勢（表3）相關(guān)分析結(jié)果表明，單親基因表達沉默（W2）與胞內(nèi)總糖含量呈極顯著正相關(guān)，雜交子基因特異表達（W3）與胞內(nèi)總糖含量呈顯著負相關(guān)。雙親基因表達共沉默（W1）、單親基因表達一致（W4）與胞內(nèi)總糖含量相關(guān)不顯著。雙親基因表達共沉默（W1）、雜交子基因特異表達（W3）與胞內(nèi)總糖含量超親優(yōu)勢呈極顯著正相關(guān)，單親基因表達一致（W4）、單親基因表達沉默（W2）與胞內(nèi)總糖含量超親優(yōu)勢呈顯著或極顯著負相關(guān)（表4）。

表4 差異表達模式與香菇雜交子胞內(nèi)總糖含量及其超親優(yōu)勢相關(guān)分析Table4 Correlation of patterns of differential expression with intracellular polysaccharide content and its over-parent heterosis of L.edodes hybrids

3 討論

雜種優(yōu)勢的產(chǎn)生，涉及到兩個遺傳背景不同的體系的相互作用。在相互作用過程中，雙親基因的相互促進和抑制決定了雜交子基因表達。本研究首次發(fā)現(xiàn)，香菇雜交子及其親本液體發(fā)酵存在基因差異表達，并且發(fā)現(xiàn)雜交子和親本間基因差異表達類型的比例為35.39%。在田曾元等對玉米[17]、王章奎等對小麥[18]、Xiong等[19]對水稻的親本與雜種間基因表達與雜種優(yōu)勢間關(guān)系的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，親本與雜種間不同程度的存在基因的差異表達。盡管本研究中基因差異表達類型所占比例與上述研究差異表達類型所占的比例不同，但至少表明雜交子不同于親本的基因差異表達現(xiàn)象是普遍存在的，且雜交子的遺傳表現(xiàn)不是親本遺傳物質(zhì)的簡單相加，而是兩套基因在雜種中相互作用，由此推測基因表達的調(diào)控機制與雜種優(yōu)勢的形成更值得關(guān)注。

本研究發(fā)現(xiàn)，雜交子基因特異表達（W3）與胞內(nèi)總糖含量超親優(yōu)勢呈極顯著正相關(guān)，即雜交子在雜合狀態(tài)下能夠激發(fā)某種機制，表達一些新的基因產(chǎn)物，調(diào)控參與代謝基因的各種生理生化反應(yīng)，從而表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢。這與王章奎等[18]、吳利民[20]的結(jié)果相似。同時本研究還發(fā)現(xiàn)雙親基因表達共沉默（W1）與胞內(nèi)總糖含量超親優(yōu)勢也呈極顯著正相關(guān)。這與吳敏生等[21]的結(jié)果相似。即某些基因在F1的表達受到抑制的情況下對產(chǎn)生正向雜種優(yōu)勢可能有利。這可能暗示了不但只在雜交種中特殊表達的基因，對形成雜種優(yōu)勢是起積極促進作用的，而且在形成雜交種的基因表達調(diào)控過程中，雙親的某些不利基因表達由于受到例如甲基化作用、反式作用因子等的抑制作用而不表達，從而形成雜種優(yōu)勢。

本研究中，單親基因表達沉默（W2）、單親基因表達一致（W4）與雜交子胞內(nèi)總糖含量呈顯著或極顯著負相關(guān)。這與田曾元等對玉米[17]、王章奎等對小麥[18]的試驗結(jié)果不同。田曾元等[17]研究發(fā)現(xiàn)，單親表達沉默與玉米雜種優(yōu)勢關(guān)系最密切，認為對于單親表達的基因來說，該基因在雜交種中被抑制有利于雜種優(yōu)勢的形成。而王章奎等[18]認為，單親表達一致型對雜種優(yōu)勢的產(chǎn)生有著積極的作用。這也許是因為不同生物雜種優(yōu)勢形成的遺傳機制有所不同造成的結(jié)果。

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