侯麗麗，晏永新，張 麗

(1.山西省獸藥監(jiān)察所，太原 030027;2.江西新世紀(jì)民星動(dòng)物保健品有限公司，南昌 330096;3.江西出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，南昌 330002)

復(fù)方防己口服液是《中國(guó)獸藥典》2010年版二部收載的“防己散”改劑型產(chǎn)品，具有補(bǔ)腎健脾，利尿除濕之功效[1]，用于治療禽腹水綜合癥。為了提高復(fù)方防己口服液的質(zhì)量可控性，在參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[2-4]的基礎(chǔ)上，研究建立了高效液相色譜同時(shí)測(cè)定復(fù)方防己口服液中粉防己堿和防己諾林堿含量的方法。

1 材料

1.1 試驗(yàn)儀器及試劑 LC200高效液相色譜儀(N2000色譜工作站);超聲波清洗儀;電子天平(十萬(wàn)分之一);乙腈、甲醇為色譜純;去離子水自制。

1.2 對(duì)照品及樣品 粉防己堿對(duì)照品(批號(hào):110711-200507，供含測(cè)用)，防己諾林堿對(duì)照品(批號(hào):110793-200605，供含測(cè)用)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;復(fù)方防己口服液，批號(hào):110901、110902、110903，江西新世紀(jì)民星動(dòng)物保健品有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取粉防己堿對(duì)照品約10.26 mg，防己諾林堿對(duì)照品約8.92 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.2052 mg/mL粉防己堿和0.1784 mg/mL防己諾林堿對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液5 mL，至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含粉防己堿0.1026 mg、防己諾林堿0.0892 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密量取樣品溶液1 mL，加水10 mL，置分液漏斗中，加入2 mL氨水混勻，用乙酸乙酯提取3次，每次10 mL，合并乙酸乙酯提取液，于65℃水浴蒸干，殘?jiān)煤?%氨水的甲醇溶液溶解并定容于10 mL量瓶中，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性樣品溶液制備 另取不含防己藥材的陰性樣品，照2.2項(xiàng)下操作制備成陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Diamonsil C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱;乙腈-0.2%磷酸水溶液-三乙胺(63∶37∶0.05)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下，粉防己堿、防己諾林堿與其他組分得到了很好的分離，且陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖1-圖3。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性范圍 精密吸取對(duì)照品貯備液(粉防己堿0.2052 mg/mL和防己諾林堿0.1784 mg/mL)1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL 和10 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。分別精密吸取各對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以粉防己堿和防己諾林堿的色譜峰面積(y)，對(duì)其濃度(x，μg/mL)進(jìn)行線性回歸。

圖1 防己諾林堿和粉防己堿混合對(duì)照品HPLC 圖

結(jié)果回歸方程(n=6)和相關(guān)系數(shù)分別為:粉防己堿:y=9038．7x+5932．8，R2=1;防己諾林堿:y=10479x+1858．4，R2=0．9997。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，粉防己堿和防己諾林堿的色譜峰面積與濃度分別在20.52～205.2 μg/mL和 17.84～178.4 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為110901的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，測(cè)定粉防己堿和防己諾林堿的含量，結(jié)果粉防己堿的含量分別為0.4860、0.4932、0.5013、0.4851、0.4922、0.4927 mg/mL，防己諾林堿的含量分別為0.4273、0.4337、0.4421、0.4322、0.4335、0.4355 mg/mL，重復(fù)性 RSD 分別為1.19%和1.11%，表明方法可行，重復(fù)性好。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果粉防己堿的峰面積分別為 365718.4、357752.7、362612.0、365053.2、362238.1、361062.5，防己諾林堿的峰面積分別為 346695.4、345900.5、344973.9、346700.2、343491.3、343971.7，精密度 RSD 分別為0.80%和0.40%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取新配制的一份供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣1 次，記錄峰面積。結(jié)果，粉防己堿峰面積的 RSD為0.84%，防己諾林堿峰面積的RSD為0.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取己知含量的復(fù)方防己口服液(批號(hào):110901)6份，每份5 mL，置10 mL的量瓶中，分別精密加入相應(yīng)含量的粉防己堿和防己諾林堿對(duì)照品，加水至刻度，搖勻。精密吸取1 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。粉防己堿平均回收率為97.32%，RSD為0.87%，防己諾林堿平均回收率為99.05%，RSD為1.65%。結(jié)果表明，本試驗(yàn)具有良好的回收率。

表1 粉防己堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表2 防己諾林堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6 含量測(cè)定 取批號(hào)為110901、110902、110903的三批復(fù)方防己口服液樣品，按上述所述的方法進(jìn)行含量測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中粉防己堿和防己諾林堿的含量，結(jié)果如表3。

表3 三批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 復(fù)方防己口服液由11味中藥組成，成份復(fù)雜，干擾因素多。在樣品處理過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品液pH大于10時(shí)，粉防己堿和防己諾林堿處于解離狀態(tài)，用乙酸乙酯萃取能得到較高的提取率。故在樣品處理中以氨水調(diào)pH后再進(jìn)行提取，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可作為該制劑的一個(gè)定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 在色譜條件摸索過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，色譜峰峰形對(duì)流動(dòng)相pH的變化較敏感，為了改善峰形的對(duì)稱性，通常在流動(dòng)相中添加適量三乙胺或二乙胺，但三乙胺或二乙胺的用量過(guò)大將導(dǎo)致流動(dòng)相pH值偏高，影響色譜柱的使用壽命。為了找到合適的流動(dòng)相，試驗(yàn)中比較了乙腈-甲醇-水-冰醋酸(40∶30∶30∶1)(每100 mL含十二烷基磺酸鈉0.41g)、0.06%二乙胺的甲醇-乙腈-水(3∶1∶1)、甲醇 -乙腈 -0.002 mol/L磷酸二氫鉀-二乙胺(55∶25∶20∶0.06)、0.06%三乙胺-乙腈溶液(44∶56)、乙腈-0.2%磷酸水溶液-三乙胺(63∶37∶0.05)等展開(kāi)系統(tǒng)，綜合考慮，以乙腈-0.2%磷酸水溶液-三乙胺(63∶37∶0.05)為流動(dòng)相分離效果最為理想。

3.3 本方法準(zhǔn)確靈敏，可作為復(fù)方防己口服液中粉防己堿和防己諾林堿的定量分析方法，為進(jìn)一步制定復(fù)方防己口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)，并對(duì)含有粉防己堿和防己諾林堿的其他產(chǎn)品的含量測(cè)定方法也具有一定的參考價(jià)值。

[1]中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典2010年版二部[S].

[2]劉永剛，劉 勇，何瑞杰，等.HPLC測(cè)定防己中防己諾林堿和粉防己堿的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(9):49-51.

[3]馮碧敏，葉 云，張 昊.高效液相色譜法測(cè)定防己中粉防己堿含量[J].藥物鑒定，2005，14(11):36-37.

[4]饒 毅，黎 莉，劉隆洪，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定防己藥材中防己諾林堿和粉防己堿[J].中草藥，2006，37(4):612-613.