劉寧寧，李明學(xué)，金雯

(江蘇大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，2.體育部，江蘇 鎮(zhèn)江212013)

骨骼肌是人體重要的運(yùn)動(dòng)器官，其機(jī)能的下降是衰老的重要標(biāo)志。骨骼肌衰老時(shí)，最大肌力與肌肉最大輸出功率明顯下降，主要與骨骼肌萎縮有關(guān)［1］。肌纖維總數(shù)不斷下降，從而產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的衰老性肌肉萎縮。從分子水平而言，肌纖維數(shù)目的減少是由于細(xì)胞凋亡而引起的［2］。增齡過(guò)程中，線粒體功能紊亂，導(dǎo)致肌細(xì)胞凋亡速度加快，肌纖維數(shù)量下降［3］。因此，可采取有效措施來(lái)降低骨骼肌細(xì)胞的凋亡，從而延緩肌肉衰老的發(fā)生發(fā)展。本文通過(guò)研究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老模型大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響，來(lái)探討有氧運(yùn)動(dòng)延緩骨骼肌細(xì)胞衰老的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

D-半乳糖(Sigma公司)，Bax單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體(Santa Cruz公司);HRP-羊抗大鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);增強(qiáng)發(fā)光劑試劑盒(Amersham Biosciences公司);TUNEL檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

21月齡雌性SD大鼠8只(老年對(duì)照組)，體質(zhì)量(400±10)g;3月齡雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±10)g。所有大鼠均由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分籠飼養(yǎng)，每籠8只，飼以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，不限制飲食，自由飲水，室溫18～23℃，相對(duì)濕度41% ～57%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后建造模型。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練

將40只3月齡雌性SD大鼠隨機(jī)分成青年對(duì)照組(n=8)和衰老模型組(n=32)，采用D-半乳糖腹部皮下注射法建立衰老模型［4－5］。用生理鹽水將D-半乳糖配置成5%的注射液，衰老模型組大鼠每天注射1次(500 mg/kg)，青年對(duì)照組則每天注射相應(yīng)劑量的生理鹽水，連續(xù)注射6周。末次注射后，禁食12 h，分別處死青年對(duì)照組8只、老年對(duì)照組8只和衰老模型組(隨機(jī)選取8只)。

剩余的衰老模型組SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為衰老模型對(duì)照組，3次/周運(yùn)動(dòng)組，6次/周運(yùn)動(dòng)組。運(yùn)動(dòng)采取無(wú)負(fù)重游泳的方式，水溫為(32±1)℃，水深為60 cm，并確保其不停地游泳。對(duì)照組則放入同樣溫度的淺水中。運(yùn)動(dòng)組首次游泳時(shí)間為30 min，然后以10 min/d遞加，直到90 min，以后保持不變。每次游泳結(jié)束后，用吹風(fēng)機(jī)吹干大鼠皮毛，共訓(xùn)練12周。

1.4 標(biāo)本收集

造模結(jié)束時(shí)，分別取青年對(duì)照組、老年對(duì)照組和衰老模型組大鼠的左心室游離壁全層的心肌組織，用4%低聚甲醛固定24 h，再用蔗糖沉淀過(guò)夜。然后制作冰凍切片，厚度為10 μm，每個(gè)標(biāo)本取不連續(xù)的2張，采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，判斷模型建造情況。運(yùn)動(dòng)結(jié)束時(shí)，分別取衰老模型對(duì)照組及2組運(yùn)動(dòng)組大鼠的腓腸肌組織，各分成2份，一份同上述操作，用于TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;另一份則立刻－70℃凍存，用于蛋白質(zhì)檢測(cè)。

1.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按照TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，然后于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。呈藍(lán)色的為正常細(xì)胞，呈棕黃色的為凋亡細(xì)胞。每張切片選取5個(gè)高倍視野(×400)，對(duì)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每只大鼠取2張切片。根據(jù)公式:細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.6 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

制備蛋白樣品:取凍存的骨骼肌標(biāo)本100 mg，加細(xì)胞裂解液1 mL，PMSF，蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑各10 μL，置勻漿器于冰上勻漿30 min。然后，4℃離心，12 000×g，15 min。取上清，測(cè)定蛋白含量，再加入等體積的2×上樣緩沖液，混勻后煮沸3 min，－20℃保存?zhèn)溆?。蛋白檢測(cè):配制SDS-PAGE;每孔30 μg總蛋白量上樣;電泳;轉(zhuǎn)膜，一抗為1∶400的鼠抗Bax(Bcl-2)單克隆抗體，二抗為1∶5 000的HRP-羊抗鼠IgG;曝光;用ECL發(fā)光劑顯色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 衰老模型制備的結(jié)果

TUNEL染色結(jié)果顯示(圖1)，與青年對(duì)照組比較，老年對(duì)照組及衰老模型組的凋亡心肌細(xì)胞明顯增多，老年對(duì)照組的凋亡細(xì)胞與衰老模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。老年對(duì)照組(33.692±2.766)與衰老模型組(34.146±2.931)的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著高于青年對(duì)照組(4.132±0.308)，P均＜0.05。衰老模型組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與老年對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.296，P=0.734)。

圖1 不同組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL染色(×400)Fig 1 TUNEL staining of myocytes in different groups

2.2 骨骼肌細(xì)胞凋亡和Bcl-2、Bax的表達(dá)

與衰老模型對(duì)照組比較，3次/周運(yùn)動(dòng)組和6次/周運(yùn)動(dòng)組的骨骼肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和Bax蛋白的表達(dá)均明顯降低，而B(niǎo)cl-2蛋白的表達(dá)和Bcl-2與Bax比值明顯升高;與6次/周運(yùn)動(dòng)組相比，3次/周運(yùn)動(dòng)組骨骼肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(t=2.928，P＜0.05)和 Bax的表達(dá)(t=3.478，P＜0.05)明顯降低，而B(niǎo)cl-2表達(dá)(t=3.045，P＜0.05)和 Bcl-2與Bax比值明顯升高(t=4.643，P＜0.05)。見(jiàn)圖2、圖 3、表 1。

圖2 不同組大鼠骨骼肌細(xì)胞TUNEL染色(×400)Fig 2 TUNEL staining of skeletal muscle cells in different groups

表1 不同組骨骼肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)±sTab 1 Apoptosis index of skeletal muscle and exprssions of Bcl-2 and Bax in different groups

表1 不同組骨骼肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)±sTab 1 Apoptosis index of skeletal muscle and exprssions of Bcl-2 and Bax in different groups

a:P＜0.01，與對(duì)照組比較;b:P＜0.05，與6次/周運(yùn)動(dòng)組比較

±0.031 6次/周運(yùn)動(dòng)組(n=8) 44.680±2.060a 0.787±0.052a 0.877±0.025a 0.693±0.025a 3 次/周運(yùn)動(dòng)組(n=8) 41.130 ±2.175a，b 0.850 ±0.054a，b 0.790 ±0.014a，b 0.743 ±0.015a，b F值 8.452 10.348 16.756 5.639 P值/% Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax對(duì)照組(n=8) 48.960±4.163 0.590±0.031 1.053±0.042 0.620組別 凋亡指數(shù)0.007 0.006 0.004 0.009

圖3 免疫印跡法檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)Fig 3 Western blot analysis of protein expressions of Bcl-2 and Bax

3 討論

D-半乳糖致衰老模型是我國(guó)學(xué)者基于衰老的代謝學(xué)說(shuō)而復(fù)制的模型，系在一定的時(shí)間內(nèi)給動(dòng)物連續(xù)注射D-半乳糖，使其細(xì)胞內(nèi)濃度增高，經(jīng)醛糖還原酶催化形成半乳糖醇，后者不能被進(jìn)一步代謝而堆積于細(xì)胞內(nèi)，影響細(xì)胞滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，功能障礙，代謝紊亂，最終致機(jī)體衰老。尹彤等［6］將自然衰老小鼠與D-半乳糖致衰老小鼠的重要臟器形態(tài)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，D-半乳糖致衰老小鼠心臟病理組織學(xué)與自然衰老小鼠相似。Kajstura等［7］研究指出，24月齡小鼠的左心室心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率較16月齡小鼠增加了近2倍。這種心肌細(xì)胞凋亡隨齡性增加的現(xiàn)象，導(dǎo)致衰老小鼠的心肌細(xì)胞比青年小鼠減少了30%［7］。因此，衰老與否，可以用心肌細(xì)胞的凋亡來(lái)檢測(cè)，因其發(fā)生率隨年齡增加而增加，并且該現(xiàn)象僅局限于左心室的游離壁心肌細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)對(duì)青年對(duì)照組大鼠、衰老模型組大鼠及老年對(duì)照組大鼠采用TUNEL法進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)。結(jié)果顯示，衰老模型組大鼠與老年對(duì)照組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯高于青年對(duì)照組大鼠，且兩者比較相似，表明衰老模型大鼠可代替自然衰老大鼠進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的研究。

細(xì)胞凋亡是受多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因家族包括C-myc、抑癌基因P53等。Bcl-2家族蛋白在線粒體介導(dǎo)的凋亡通路中起重要調(diào)節(jié)作用，可分為2類:一類是抗凋亡，另一類是促凋亡。其中，Bcl-2和Bax這一對(duì)功能基因在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用，兩者水平的高低與細(xì)胞凋亡直接相關(guān)。Bax增高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;Bcl-2增高，則抑制細(xì)胞凋亡。Bax與Bcl-2兩者間的比例是決定細(xì)胞凋亡與否的關(guān)鍵因素［8］。Bax/Bcl-2＞1時(shí)，細(xì)胞趨向于凋亡;Bax/Bcl-2＜1時(shí)，細(xì)胞趨向于存活。隨著年齡的增加，增多的活性氧等物質(zhì)可誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax與Bcl-2結(jié)合的復(fù)合物解離并轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，使線粒體膜形成孔洞，釋放出細(xì)胞色素C，從而激活整個(gè)凋亡途徑［9］。吳薇等［10］的研究顯示，衰老小鼠的 Bcl-2 表達(dá)減少，Bax表達(dá)升高，Bax/Bcl-2比例升高，提示Bcl-2蛋白家族介導(dǎo)的凋亡通路被激活，線粒體膜的完整性被破壞，釋放出促凋亡物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與細(xì)胞凋亡關(guān)系的實(shí)驗(yàn)表明，適宜的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度不會(huì)引起細(xì)胞凋亡的增加;而力竭運(yùn)動(dòng)和超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)時(shí)，大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加，且運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度與細(xì)胞凋亡的程度成正相關(guān)［11］。有氧運(yùn)動(dòng)可改變Bcl-2/Bax比值，從而影響骨骼肌細(xì)胞的凋亡。Song等［12］研究發(fā)現(xiàn)，老年大鼠在進(jìn)行了12周的跑臺(tái)耐力訓(xùn)練后，比目魚(yú)肌和腓腸肌中抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)較對(duì)照組大鼠顯著增加，而B(niǎo)ax及Bax/Bcl-2比值均降低，比目魚(yú)肌和腓腸肌細(xì)胞凋亡指數(shù)隨之降低。Marzetti等［13］研究發(fā)現(xiàn)，28月齡的雄性Fischer 344大鼠骨骼肌凋亡率較8月齡雄性Fischer 344大鼠增加20.3%，而經(jīng)過(guò)4周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，其骨骼肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低。Siu等［14］對(duì)成年SD大鼠進(jìn)行8周中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，8周后運(yùn)動(dòng)組大鼠比目魚(yú)肌中Bcl-2表達(dá)較對(duì)照組增加，而B(niǎo)ax則較對(duì)照組下降。本研究表明，運(yùn)動(dòng)組經(jīng)過(guò)12周的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，均出現(xiàn)Bax蛋白表達(dá)下降，Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax比值升高，骨骼肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，且3次/周運(yùn)動(dòng)組的骨骼肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較6次/周運(yùn)動(dòng)組下降得更明顯，這說(shuō)明隔日運(yùn)動(dòng)更有利于延緩骨骼肌細(xì)胞衰老。

綜上所述，長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可以降低骨骼肌細(xì)胞凋亡，可能是由于有氧運(yùn)動(dòng)造成骨骼肌細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的變化而引起的。

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