翟榮榮，蔣金鳳，張濟(jì)，丁永斌，王建華，魏繼福

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部研究室，江蘇 南京210029;2.中國科學(xué)院上海巴斯德研究所病毒免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海200025;3.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，江蘇南京210029)

肥大細(xì)胞是定位于組織的一類胞質(zhì)內(nèi)富含嗜堿性顆粒的細(xì)胞［1］，與哮喘、變態(tài)反應(yīng)等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。近年來，肥大細(xì)胞在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、防御病原微生物入侵等方面的作用正在引起人們的關(guān)注。目前主要采用HMC-1，一種從肥大細(xì)胞淋巴瘤(mast cell leukaemia)患者中分離轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系研究肥大細(xì)胞。HMC-1與機(jī)體生理?xiàng)l件下肥大細(xì)胞的差異，限制了對(duì)肥大細(xì)胞功能的深入研究。鑒于此，我們建立了兩種人原代肥大細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)和分離方法，兩法均可獲得純度較高、狀態(tài)良好的肥大細(xì)胞，可適用于肥大細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)和病原防御中作用的后續(xù)研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和組織 健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)購于上海市血液中心;直腸和(或)結(jié)腸組織由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科提供?；颊吆炇鹬橥鈺?，并獲得南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和抗體 β-巰基乙醇和 RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，膠原蛋白水解酶Ⅰ型和甲苯胺藍(lán)(Sigma公司)，透明質(zhì)酸酶(Worthington公司)，脫氧核糖核酸酶(DNase)Ⅰ型(Roche公司)，Percoll分離液(GE公司)，抗CD34抗體包被的磁珠、抗CD117抗體包被的磁珠和MACS細(xì)胞分選緩沖液(Miltenyi公司)，重組人源干細(xì)胞因子(Stem cell factor，SCF)、IL-6 和 IL-3(R＆D 公司)，類胰蛋白酶抗體(Millipore公司)，熒光封片試劑(DAKO公司)，APC(Allophycocyanin)標(biāo)記的抗人CD117抗體(Biolegend公司)，APC標(biāo)記的抗人 FcεR I抗體(eBioscience公司)，藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的抗人CD4抗體、APC標(biāo)記的抗人CXCR4抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗人CD34抗體和APC-cy7標(biāo)記的抗人CCR5抗體(BD公司)。

1.2 CD34+細(xì)胞向肥大細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

根據(jù)Saito等［2］描述的方法分離 CD34+細(xì)胞。PBMC中加入相應(yīng)量的抗CD34抗體包被的磁珠，4℃孵育30 min，用MACS細(xì)胞分選緩沖液洗滌2次，重懸細(xì)胞，過MACS細(xì)胞分選柱(規(guī)格:LS)進(jìn)行分選，收集CD34+細(xì)胞。將CD34+細(xì)胞用含100 ng/mL SCF、50 ng/mL IL-6和5 ng/mL IL-3的 RPMI-1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基［3］培養(yǎng)1周后，更換為含100 ng/mL SCF和50 ng/mL IL-6的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以后每周半量換液，細(xì)胞密度保持在2×105/mL。培養(yǎng)4周作為肥大細(xì)胞前體(progenitor mast cells)，培養(yǎng)11周作為成熟的肥大細(xì)胞。

1.3 分離人腸道黏膜細(xì)胞

取直腸癌或結(jié)腸癌患者手術(shù)后的無病變組織，用含高濃度抗生素(1 000 U/mL青霉素、1 000 U/mL鏈霉素、5%甲硝唑和2%慶大霉素)的 Hank's平衡鹽溶液(HBSS)洗滌組織，除去表面血跡，剝離腸道表面的脂肪和結(jié)締組織;縱向剖開腸道，將組織置于無菌紙上，吸去黏膜表面多余黏液，然后剝離黏膜組織，在HBSS液中洗滌，直至液體澄清;將組織剪成1 cm3小塊，放入含2 mmol/L EDTA/7 mmol/L β-巰基乙醇的 HBSS液，37℃，60 r/min磁力攪拌10 min，洗滌2次，再放入含5 mmol/L EDTA的HBSS液，37℃，60 r/min磁力攪拌20 min，洗滌1次，然后轉(zhuǎn)入含5%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640溶液，37℃，60 r/min磁力攪拌30 min，平衡組織中Ca2+和Mg2+;接著將組織剪成1 mm2，加入含5%FBS、75 U/mL 膠原酶(0.278 mg/mL)、72 U/ml透明質(zhì)酸酶(0.1 mg/mL)和 50 U/mL脫氧核糖核酸酶(0.025 mg/mL)的 RPMI-1640培養(yǎng)基中消化組織4次，將收集的單細(xì)胞懸液混合，過 100目尼龍網(wǎng)，400×g離心 10 min，1 mmol/L EDTA-PBS溶液重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度保持在107/mL左右。

1.4 Percoll密度梯度離心富集細(xì)胞

在50 mL離心管中依次加入12 mL 1.119 g/mL Percoll分離液和 1.077 g/mL Percoll，然后加入24 mL上述腸道黏膜細(xì)胞懸液，700×g，升降速為0，離心10 min，單個(gè)核細(xì)胞位于1.077 g/mL Percoll上層，粒細(xì)胞位于1.077 g/mL和1.119 g/mL Percoll交界處。收集粒細(xì)胞，用5倍體積的含5%FBS和1%Pen/strep的RPMI 1640溶液洗滌，200×g離心10 min，重復(fù)1次，MACS緩沖液重懸細(xì)胞。

1.5 抗CD117抗體包被的磁珠純化肥大細(xì)胞

MACS緩沖液重懸細(xì)胞，加入相應(yīng)量抗CD117抗體包被的磁珠，4℃，孵育15 min，MACS緩沖液洗滌2次，重懸細(xì)胞，過LS柱，收集CD117陽性細(xì)胞，用含100 ng/mL SCF和50 ng/mL IL-6的RPMI-1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.6 肥大細(xì)胞的鑒定

1.6.1 甲苯胺藍(lán)染色 肥大細(xì)胞貼片，用4%低聚甲醛固定，再用酸性甲苯胺藍(lán)染色60 min，流水沖至無色，封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.2 免疫熒光染色 肥大細(xì)胞貼片，4% 低聚甲醛固定，0.1%Triton-10%牛血清白蛋白-PBS封閉破膜，室溫1 h，洗滌，加鼠抗人類胰蛋白酶抗體，4℃，孵育過夜;洗滌，Alexa Fluor 488綠色熒光二抗室溫孵育1 h，洗滌，DAPI染色5 min，洗滌，封片，用德國Leica公司激光共聚焦顯微鏡(SP5)觀察。

1.6.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測表型 加入抗人CD34、FcεRⅠ、CD117、CD4、CXCR4 和 CCR5 抗體，4℃孵育15 min，PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞后用BD公司的流式細(xì)胞儀LSRⅡ進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 CD34+干細(xì)胞的分離與肥大細(xì)胞的誘導(dǎo)

CD34是造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物，用抗CD34包被的磁珠分離PBMC中的CD34+干細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析表明，CD34+細(xì)胞的純度高達(dá)80%～90%，見圖1。臺(tái)盼藍(lán)拒染顯示，細(xì)胞活力約為95%。

類胰蛋白酶在肥大細(xì)胞中含量高，且具有高度選擇性［4］，因此可作為此處的鑒定指標(biāo)。由圖2可以看出，剛分離出的CD34+細(xì)胞，類胰蛋白酶熒光染色陰性。誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后，即成為前體肥大細(xì)胞，此時(shí)類胰蛋白酶陽性細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)，且百分率較高。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，前體肥大細(xì)胞逐漸成熟，11周后，單個(gè)細(xì)胞中的類胰蛋白酶表達(dá)量進(jìn)一步提高，且細(xì)胞陽性率接近百分之百。

圖1 CD34+細(xì)胞的分離Fig 1 Isolation of CD34+cells

圖2 CD34+細(xì)胞來源的肥大細(xì)胞內(nèi)類胰蛋白酶的表達(dá)(免疫熒光染色×63)Fig 2 Tryptase expression in CD34+cell-derived mast cell

2.2 腸道黏膜組織分離的肥大細(xì)胞

先將腸道黏膜組織制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)抗CD117抗體包被的磁珠分選后獲得成熟肥大細(xì)胞。甲苯胺藍(lán)可將肥大細(xì)胞胞內(nèi)顆粒染成紫紅色，核染成淺藍(lán)色，以此鑒定肥大細(xì)胞［5］和分析分選效果(圖3)，黏膜組織單細(xì)胞懸液中偶見肥大細(xì)胞，而免疫磁珠分離后的細(xì)胞則大多呈甲苯胺藍(lán)染色陽性。

2.3 肥大細(xì)胞胞內(nèi)類胰蛋白酶和膜表面分子標(biāo)志物

肥大細(xì)胞的功能有賴于其胞內(nèi)的生物活性介質(zhì)(如類胰蛋白酶)和膜表面CD117和FcεRⅠ的表達(dá)水平。圖4顯示，類胰蛋白酶熒光染色，CD34+細(xì)胞來源的成熟肥大細(xì)胞雖然比前體肥大細(xì)胞的熒光強(qiáng)度略高，但兩者都明顯弱于腸道黏膜肥大細(xì)胞。流式分析顯示相似的結(jié)果(圖5)，培養(yǎng)4周和11周的肥大細(xì)胞不再表達(dá)干細(xì)胞分子標(biāo)志CD34;CD117和FcεRⅠ雖有表達(dá)，但表達(dá)率低于腸道黏膜肥大細(xì)胞。

圖3 腸道黏膜組織分離出的肥大細(xì)胞(甲苯胺藍(lán)染色×100)Fig 3 Mast cells isolated from human intestinal

圖4 兩種來源的肥大細(xì)胞胞內(nèi)類胰蛋白酶染色(免疫熒光染色×480)Fig 4 Expression of tryptase in mast cells generated by two methods

圖5 兩種來源的肥大細(xì)胞表型Fig 5 Phenotype of mast cells generated by two methods

另外，腸道黏膜是人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)感染的重要部位，于是我們從HIV-1相關(guān)研究的應(yīng)用方面將這兩類肥大細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)常用的肥大細(xì)胞系HMC-1進(jìn)行比較。HIV-1膜表面gp120與細(xì)胞膜上CD4結(jié)合，再借助CXCR4、CCR5等輔助受體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)［6－7］。圖6所示，HMC-1幾乎不表達(dá)CD4、CXCR4;CD34+細(xì)胞來源的肥大細(xì)胞表達(dá)低水平的CD4，較高水平的CXCR4和CCR5;3種CD分子在腸道黏膜肥大細(xì)胞均有很好的表達(dá)，提示在病毒感染相關(guān)研究方面，原代肥大細(xì)胞比細(xì)胞系的使用價(jià)值更高。

3 討論

肥大細(xì)胞來源于骨髓CD34+造血干細(xì)胞，經(jīng)血液循環(huán)歸巢到不同組織中。肥大細(xì)胞不同于其他免疫細(xì)胞，僅在組織中發(fā)現(xiàn)成熟的肥大細(xì)胞，血液中為前體肥大細(xì)胞。因此成熟肥大細(xì)胞只存在血管周圍和與外界環(huán)境接觸的皮膚及黏膜組織，且受不同組織微環(huán)境的影響，具有特異性的表型。因而獲得成熟肥大細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過程。FcεRⅠ和CD117(c-kit)是肥大細(xì)胞表面調(diào)控其功能的重要受體［8－10］。因此，鑒于肥大細(xì)胞的骨髓造血干細(xì)胞分化起源和細(xì)胞表面分子表達(dá)特征，我們描述了兩種人原代肥大細(xì)胞的體外刺激培養(yǎng)和分離方法。

圖6 原代肥大細(xì)胞與肥大細(xì)胞系HMC-1的表型比較Fig 6 Phenotype comparison of primary mast cells generated by two methods and HMC-1

結(jié)合機(jī)械分離、酶消化、Percoll密度梯度離心富集和單克隆抗體磁珠純化方法而建立的人腸道組織肥大細(xì)胞分離法，提供了一種獨(dú)特組織來源肥大細(xì)胞。但是分離過程中會(huì)受到如下因素的限制:①供體年齡和組織保存時(shí)間。年齡較大、保存時(shí)間較長，分離出的細(xì)胞存活率低，不能用于后續(xù)磁珠純化。②不同密度Percoll的密度精確度。精確度不好會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分層錯(cuò)誤，降低得率。③ 細(xì)菌或真菌污染。腸道本身菌群復(fù)雜，即使加入高濃度廣譜抗生素和真菌類抗生素(如兩性霉素B)后，仍存在污染的風(fēng)險(xiǎn)。④組織塊大小。10 g腸道組織只可以分離得到0.5×106～4×106個(gè)肥大細(xì)胞，與肺部組織中分離肥大細(xì)胞的得率相近。⑤耗時(shí)，整個(gè)分離過程大概需要8 h以上。鑒于組織肥大細(xì)胞分離方法的復(fù)雜性，一種通過細(xì)胞因子刺激來自骨髓、臍帶血或外周血CD34+造血干細(xì)胞體外分化，生成成熟肥大細(xì)胞的替代方法展現(xiàn)了其吸引力。本文通過SCF、IL-6和IL-3刺激外周血CD34+造血干細(xì)胞得到了大量形態(tài)一致的、純度較高、活性較好的肥大細(xì)胞。但是這些肥大細(xì)胞因培養(yǎng)時(shí)缺乏體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境，有時(shí)和細(xì)胞系(如HMC-1)一樣，在表型上趨于不成熟，導(dǎo)致不能更真實(shí)地模擬肥大細(xì)胞體內(nèi)功能。此外，由于我們是加入血清培養(yǎng)，增加了CD34+細(xì)胞多向分化的能力［11］，一定的未知類型細(xì)胞可能干擾后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

肥大細(xì)胞通過其表面受體及釋放的炎癥介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。早期研究中主要介紹肥大細(xì)胞參與過敏和炎癥反應(yīng)，如腸道肥大細(xì)胞參與了腸過敏、乳糜瀉和炎癥性腸病(IBD)等腸道疾病的致病過程。近年來，肥大細(xì)胞在感染性疾病中的作用和免疫防御功能受到關(guān)注，更有研究指出肥大細(xì)胞是HIV-1潛伏感染儲(chǔ)存庫［12］。我們的數(shù)據(jù)顯示兩種原代肥大細(xì)胞都表達(dá)CD4、CXCR4和CCR5，這與Sundstrom等［12］的數(shù)據(jù)并不矛盾，因?yàn)槟c道肥大細(xì)胞本身就存在5% ～15%前體細(xì)胞［13］，且Sundstrom等研究的胎盤肥大細(xì)胞與腸道肥大細(xì)胞也存在差異。腸道黏膜是HIV-1感染的重要部位，因此，原代肥大細(xì)胞在HIV-1的黏膜感染和潛伏感染研究方面也具有重要的意義。

［1］ Krishnaswamy G，Ajitawi O，Chi DS.Methods in Molecular Biology［M］.Clifton，New Jersey:Humana Press，2006:13 －34.

［2］ Saito H，Kato A，Matsumoto K，et al.Culture of human mast cells from peripheral blood progenitors［J］.Nat Protoc，2006，1(4):2178 －2183.

［3］ Jamur MC，Oliver C.Origin，maturation and recruitment of mast cell precursors［J］.Front Biosci(Schol Ed)，2011，3(6):1390 －1406.

［4］ Hagel AF，Derossi T，Zopf Y，et al.Mast cell tryptase levels in gut mucosa in patients with gastrointestinal symptoms caused by food allergy［J］.Int Arch Allergy Immunol，2012，160(4):350 －355.

［5］ Huang S，Lu F，Chen Y et al.Mast cell degranulation in human periodontitis［J］.J Periodontol，2013，84(2):248－255.

［6］ Pollakis G，Paxton WA.Use of(alternative)coreceptors for HIV entry［J］.Curr Opin HIV AIDS，2012，7(5):440－449.

［7］ Cashin K，Roche M，Sterjovski J，et al.Alternative coreceptor requirements for efficient CCR5-and CXCR4-mediated HIV-1 entry into macrophages［J］.J Virol，2011，85(20):10699－10709.

［8］ Jensen BM，Akin C，Gilfillan AM.Pharmacological targeting of the KIT growth factor receptor:a therapeutic consideration for mast cell disorders［J］.Br J Pharmacol，2008，154(8):1572 －1582.

［9］ El-Agamy DS.Targeting c-kit in the therapy of mast cell disorders:current update［J］.Eur J Pharmacol，2012，690(1):1－3.

［10］ Ray P，Krishnamoorthy N，Oriss TB，et al.Signaling of c-kit in dendritic cells influences adaptive immunity［J］.Ann N Y Acad Sci，2010，1183(5):104 －122.

［11］ Xu Y，Liu L，Zhang L，et al.Efficient commitment to functional CD34+progenitor cells from human bone marrow mesenchymal stem-cell-derived induced pluripotent stem cells［J］.PLoS One，2012，7(4):e34321.

［12］ Sundstrom JB，Ellis JE，Hair GA，et al.Human tissue mast cells are an inducible reservoir of persistent HIV infection［J］.Blood，2007，109(12):5293 －5300.

［13］ Sellge G，Bischoff SC.Methods in molecular biology［M］.Clifton，New Jersey:Humana Press，2006:123 －138.