魏文婷，張濤，江波，沐萬孟，繆銘

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

甘露醇是一種天然糖醇，許多水果和蔬菜如南瓜、蘑菇、洋蔥和海藻，尤其是褐色海藻中均有存在［1］。甘露醇具有不吸濕，甜度適宜，熱量低，無毒副作用，在人體內(nèi)代謝與胰島素?zé)o關(guān)，不提高血糖值，不致齲齒等特點(diǎn)，可用作糖尿病人、肥胖病人的甜味劑和功能性食品添加劑［2］。在目前工業(yè)化生產(chǎn)甘露醇所采用的方法中，除提取法外，其他方法均伴有副產(chǎn)物山梨醇的產(chǎn)生，不僅降低了原料轉(zhuǎn)化為甘露醇的轉(zhuǎn)化率，也為甘露醇的分離和純化帶來了困難［3］。而發(fā)酵法能夠利用酶系統(tǒng)完成立體有選擇的氫化作用，所得的甘露醇產(chǎn)率高且不產(chǎn)生山梨醇［4］，具有選擇性高，反應(yīng)條件溫和的優(yōu)勢(shì)［5］。

自然界中許多微生物可以發(fā)酵生產(chǎn)甘露醇，如細(xì)菌、酵母菌、真菌等［6－8］。近些年人們多關(guān)注于異型發(fā)酵的乳酸菌、明串珠菌，它們主要將果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇［9］。YUN［10］等研究了2 株乳酸菌產(chǎn)甘露醇的條件，它們利用100 g/L果糖分別得到73和26 g/L的甘露醇。侯建革［11］等采用布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)發(fā)酵48 h產(chǎn)生甘露醇68.5 g/L，培養(yǎng)基總糖為 150 g/L，其中果糖與葡萄糖比值為 3∶1。Song［7］等篩選出1株木蘭假絲酵母，利用150 g/L果糖搖瓶培養(yǎng)168 h可產(chǎn)生67 g/L甘露醇。但果糖作為底物相對(duì)比較昂貴，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，為了降低生產(chǎn)成本，必需選擇廉價(jià)的底物［12］。

為了克服上述缺點(diǎn)，本文首先從甘蔗汁中篩選出1株利用葡萄糖產(chǎn)甘露醇的菌株，經(jīng)鑒定為近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)。它能以高濃度葡萄糖為原料得到較高產(chǎn)量的甘露醇，且不必添加果糖。葡萄糖價(jià)格相對(duì)低廉，并且大量存在于自然界中，降低了生產(chǎn)成本，這對(duì)于今后工業(yè)化制備甘露醇具有較大的應(yīng)用價(jià)值。本文在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到了發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的最佳培養(yǎng)基，并利用此培養(yǎng)基進(jìn)行30 L發(fā)酵分批培養(yǎng)，探索利用該菌種發(fā)酵產(chǎn)甘露醇工業(yè)化生產(chǎn)條件。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為CCTCC No.M 2012491。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 500，酵母膏 10，pH 5.0。

篩選培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖500，酵母膏10，瓊脂20，pH 5.0。

斜面保藏培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母膏 20，瓊脂 20，pH 5.0。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20，酵母膏 20，pH 5.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖150，酵母膏20，MgSO42，KH2PO42，pH 5.0。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀;Agilent 1260;分離柱;Sugarpak-1鈣型陽離子交換柱;檢測(cè)器;Shodex RI-101示差折光檢測(cè)器;30 L發(fā)酵罐;揚(yáng)中市威柯特生物工程設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種篩選方法

取自然放置72 h的甘蔗汁(市購)10 mL接種于100 mL已滅菌的富集培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)48 h，然后取1 mL培養(yǎng)液梯度稀釋涂布于篩選培養(yǎng)基上，倒置于30℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。利用高濃度葡萄糖形成的高滲透壓(低水活度)環(huán)境進(jìn)行初篩，觀察微生物生長情況，用接種環(huán)挑選微生物形態(tài)、大小、色澤等不同的菌落進(jìn)行3次平板劃線純化，得到的純菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h保存。從斜面培養(yǎng)基上挑取1環(huán)接種到初始發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)酵條件為30℃，200 r/min，培養(yǎng)72 h。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液10 000 r/min離心20 min取上清液，用HPLC檢測(cè)上清液中是否有甘露醇存在。

1.3.2 培養(yǎng)方法

將生長良好的斜面菌種1環(huán)，接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:30℃，200 r/min，培養(yǎng)24 h。然后以4%接種量接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，培養(yǎng)條件:30℃，200 r/min，培養(yǎng)72 h。

1.3.3 生物量的測(cè)定

離心干重法:發(fā)酵液30 mL在4 000 r/min下離心10 min收集細(xì)胞，蒸餾水洗滌2次再離心，60℃烘干至恒重。

1.3.4 甘露醇產(chǎn)量和葡萄糖的含量

甘露醇和葡萄糖測(cè)定:HPLC法。將發(fā)酵液10 000 r/min離心20 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm 膜過濾后用HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中甘露醇產(chǎn)量和葡萄糖的含量。

色譜條件:流動(dòng)相:純水(經(jīng)0.45 μm膜過濾);流速:0.4 mL/min，柱溫:85 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

1.3.5 葡萄糖和果糖對(duì)近平滑假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的影響

改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基里的碳源，分別以葡萄糖、葡萄糖和果糖質(zhì)量比分別為 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的混合物以及果糖作為不同的碳源進(jìn)行研究，碳源總濃度均為150 g/L;其次考慮最適碳源的濃度對(duì)近平滑假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的影響。

1.3.6 氮源對(duì)近平滑假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的影響

改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基里的氮源，研究不同種類氮源(酵母膏、牛肉膏、麥芽浸膏、胰蛋白胨、魚粉蛋白胨以及尿素)對(duì)近平滑假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的影響;其次考察最適氮源的添加量。

1.3.7 無機(jī)鹽對(duì)近平滑假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的影響

分別以不同濃度梯度的無機(jī)鹽(CaCl2·2H2O、FeCl3·2H2O、MgSO4·7H2O、CoCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、NiCl2·2H2O 以及 MnSO4·4H2O)添加到初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，比較無機(jī)鹽對(duì)近平滑假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的影響。

1.3.8 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以葡萄糖、酵母膏、CaCl2·2H2O、FeCl3·2H2O以及MgSO4·7H2O濃度為5因素，設(shè)計(jì)L16(45)正交實(shí)驗(yàn)。

1.3.9 30 L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)所得優(yōu)化培養(yǎng)基，將近平滑假絲酵母在30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)，接種量為4%，初始 pH 5.0，30 ℃，通氣量0.5 vvm，轉(zhuǎn)速 200 r/min，定期取樣測(cè)定發(fā)酵過程中生物量、pH、葡萄糖以及甘露醇含量的變化情況。

2 結(jié)果和討論

2.1 菌種篩選和鑒定

2.1.1 高效液相對(duì)樣品的檢測(cè)結(jié)果

利用以高濃度葡萄糖為唯一碳源的富集培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基，從甘蔗汁中分離得到的SK26.001產(chǎn)甘露醇能力最高，其HPLC測(cè)定結(jié)果如圖1和圖2所示。菌株產(chǎn)生的菌落呈粘稠污白色，顯微鏡下為單細(xì)胞個(gè)體，呈球形橢圓形等，未見芽殖及假絲菌，如圖3所示。

圖1 葡萄糖和甘露醇標(biāo)樣的HPLC圖Fig.1 HPLC profiles of standard glucose and mannitol

圖2 發(fā)酵液HPLC圖Fig.2 HPLC profiles of fermentation liquid

圖3 菌株SK26.001的細(xì)胞形態(tài)(×400)Fig.3 The morphology of the strain SK26.001(×400)

2.1.2 菌種鑒定結(jié)果

進(jìn)行18S rDNA測(cè)序，結(jié)果表明:菌株SK26.001的18S rDNA序列含有1446個(gè)堿基。將該序列進(jìn)行BLAST比 對(duì) 發(fā) 現(xiàn)，該 菌 株 與 C.parapsilosis BG090809.6.8.4.1.12(JQ008831.1)同源性最高，18S rDNA序列同源性達(dá)100%。依據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特性等特征，參照細(xì)菌鑒定手冊(cè)［13］，結(jié)合18S rDNA序列比對(duì)結(jié)果，鑒定SK26.001為近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)。將 C.parapsilosis SK26.001的18S rDNA序列提交到GenBank得到登錄號(hào)為KF255835，并將其保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC No.M 2012491。

2.2 葡萄糖和果糖對(duì)近平滑假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的影響

研究不同配比的葡萄糖和果糖對(duì)近平滑假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同配比碳源對(duì)發(fā)酵過程的影響Fig.4 Effect of different proportion of carbon sources on fermentation

從圖4可以看出，雖然利用不同配比的葡萄糖和果糖都能獲得與葡萄糖接近的生物量，但甘露醇的產(chǎn)量都不及僅以葡萄糖為碳源時(shí)的產(chǎn)量高，這說明近平滑假絲酵母代謝不同糖類的機(jī)制可能不同，影響到細(xì)胞內(nèi) mannitol dehydrogenase、mannitol-1-phosphatase的活力和合成［1］，最終造成甘露醇的合成受限。近平滑假絲酵母以果糖為碳源也可以產(chǎn)生少量的甘露醇，但是果糖的存在反而減少甘露醇的生成，隨著果糖比例的增加，甘露醇的產(chǎn)量隨之減少。因此，選擇葡萄糖作為唯一碳源，并研究不同濃度葡萄糖對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響。

從圖5可以清晰看出，葡萄糖含量為200 g/L時(shí)獲得最大的甘露醇產(chǎn)量，但隨著糖含量進(jìn)一步增加，甘露醇產(chǎn)量反而降低，這是因?yàn)楦事洞际艿孜锲咸烟菨舛鹊挠绊?，葡萄糖濃度過大，不僅對(duì)菌體生長抑制作用增加，也影響甘露醇的轉(zhuǎn)化生成，這可能是由于滲透壓過高而引起的［7］，酵母通過胞內(nèi)積累多元醇等相容性溶質(zhì)來適應(yīng)高滲環(huán)境生長，甘油被認(rèn)為是主要的相容性溶質(zhì)［14］。這些相容性溶質(zhì)可以以較高的濃度在細(xì)胞內(nèi)積累而對(duì)細(xì)胞酶系出現(xiàn)抑制或滅活［15］。

圖5 葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵過程的影響Fig.5 Effect of glucose concentration on fermentation

2.3 氮源對(duì)近平滑假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的影響

氮源對(duì)甘露醇發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，氮源對(duì)甘露醇發(fā)酵影響比較大，其中酵母膏的效果最好。酵母膏富含完全蛋白質(zhì)，均衡的必需氨基酸以及B族維生素、核苷酸、微量元素等，是最為理想的生物培養(yǎng)基原料和發(fā)酵工業(yè)中的主要原料，其功效與8倍的酵母相當(dāng)，可以大大提高菌種的生產(chǎn)速率及發(fā)酵產(chǎn)品得率。因此，確定酵母膏為近平滑假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的最適氮源，再研究不同濃度酵母膏對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響。

由圖7可知，在酵母膏濃度低于10 g/L時(shí)，產(chǎn)物甘露醇的生成量相對(duì)較低;當(dāng)酵母膏濃度低于5 g/L時(shí)，菌體量不高，這說明低的酵母膏濃度不能滿足菌體的生長;當(dāng)酵母膏濃度高于20 g/L時(shí)，菌體量相對(duì)變化不大，此可以判斷此時(shí)的酵母膏的量對(duì)于菌體的生長已經(jīng)滿足，但產(chǎn)物甘露醇的生成量隨著酵母膏濃度的增大而增加，在酵母膏濃度為25 g/L時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)發(fā)酵得到的甘露醇產(chǎn)量為39.1 g/L。

2.4 無機(jī)鹽對(duì)近平滑假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的影響

圖6 氮源種類對(duì)發(fā)酵過程的影響Fig.6 Effect of nitrogen sources on fermentation

圖7 酵母膏濃度對(duì)發(fā)酵過程的影響Fig.7 Effect of the concentration of yeast extract on fermentation

從圖8可以看出，CaCl2·2H2O、FeCl3·2H2O可以明顯提高甘露醇的產(chǎn)量，而MgSO4·7H2O能夠略微促進(jìn)甘露醇的生成，它們的最佳濃度分別為0.1 g/L、0.02 g/L、0.2 g/L，其中添加 0.02 g/L FeCl3·2H2O時(shí)甘露醇的產(chǎn)量達(dá)到55 g/L。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+可以減少胞內(nèi)甘露醇含量，Cu2+可以增加甘露醇脫氫酶的活力［16］，然而Cu2+對(duì)近平滑假絲酵母產(chǎn)甘露醇卻沒有促進(jìn)作用。Mg2+一般是微生物代謝路徑里很多酶的激活劑，在糖酵解、呼吸、氧化磷酸化等過程中起重要作用［17］;而Fe3+是細(xì)胞色素和鐵氧化還原蛋白的氧化還原反應(yīng)中必不可少的電子載體，在電子傳遞體系中起至關(guān)重要的作用，微生物對(duì)Fe3+的需求是微量的，濃度過高會(huì)引起抑制或毒害作用［18］。從圖9可以看出CoCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O 嚴(yán)重阻礙甘露醇的生成，而 NiCl2·2H2O、MnSO4·4H2O也對(duì)甘露醇的生成有一定影響。某些蛋白質(zhì)容易受Co2+影響而變性;Cu2+是多種生物過程的基本輔酶，當(dāng)Cu2+過量時(shí)會(huì)促使產(chǎn)生活性氧化物，與生物大分子(如蛋白質(zhì))結(jié)合，從而破壞該大分子的正常生理功能［19］。推測(cè)其余幾種金屬離子也是影響了代謝途徑中某些酶的合成和活力而使甘露醇產(chǎn)量減少。

圖8 無機(jī)鹽離子對(duì)發(fā)酵過程的影響ⅠFig.8 Effect of inorganic salt ions on fermentationⅠ

圖9 無機(jī)鹽離子對(duì)發(fā)酵過程的影響ⅡFig.9 Effect of inorganic salt ions on fermentationⅡ

2.5 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

考慮到各因素間的交互作用對(duì)甘露醇發(fā)酵的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L16(45)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2極差分析可知，各因素影響甘露醇產(chǎn)量的順序?yàn)?B＞D＞A＞C＞E，即酵母膏＞FeCl3＞葡萄糖＞CaCl2＞MgSO4，可以確定最優(yōu)條件為:A2B4C3D2E4，即葡萄糖濃度為200 g/L，酵母膏濃度為30 g/L，CaCl2·2H2O濃度為0.05 g/L，F(xiàn)eCl3·2H2O濃度為0.02 g/L，MgSO4·7H2O濃度為0.5 g/L。在此條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，甘露醇產(chǎn)量達(dá)到61.7 g/L。

2.6 30 L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)

為了研究近平滑假絲酵母的細(xì)胞生長情況和代謝規(guī)律，進(jìn)行分批發(fā)酵，將優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基一次性加入30 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵過程不流加底物葡萄糖，直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵液中甘露醇含量、葡萄糖含量、pH、生物量的變化情況，結(jié)果見圖10。由圖10可知，在前30 h酵母細(xì)胞快速生長，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，之后生物量仍有略微增長。初始pH為5，對(duì)數(shù)期時(shí)pH下降為3.7，這是由于產(chǎn)生了乳酸等酸性物質(zhì)［21］，然而72 h后pH又略有回升，這可能是由于葡萄糖耗盡引起的代謝變化，因此在發(fā)酵過程中要控制pH值來促進(jìn)甘露醇的產(chǎn)生。葡萄糖在前24 h呈線性消耗，主要是用來提供菌體生長;24 h后葡萄糖一方面是用來提供菌體生長，另一方面用來合成甘露醇，在72 h時(shí)葡萄糖完全耗盡，此時(shí)甘露醇產(chǎn)量達(dá)到最大值80.3 g/L。甘露醇在前18 h時(shí)沒有產(chǎn)生，這段時(shí)間是菌體的快速增長期。值得注意的是，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖用盡時(shí)，近平滑假絲酵母開始代謝已經(jīng)生成的甘露醇，這表明甘露醇作為碳源被消耗用來維持菌體生長，這與Gaspar P［20］報(bào)道的同型發(fā)酵乳酸菌在培養(yǎng)基中葡萄糖用盡的情況下代謝已經(jīng)生成的甘露醇的情況相一致。由此可以考慮嘗試在發(fā)酵中期補(bǔ)充葡萄糖和控制pH等方法來提高甘露醇的產(chǎn)量。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析Table 2 The results of the orthogonal experiment and range analysis

3 結(jié)論

圖10 近平滑假絲酵母的發(fā)酵曲線Fig.10 The curve of fermentation of C.parapsilosis

從甘蔗汁中篩選出了1株能利用葡萄糖產(chǎn)甘露醇的菌株，經(jīng)鑒定為近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，得到其產(chǎn)甘露醇的最佳條件為200 g/L葡萄糖，30 g/L酵母膏，0.05 g/L CaCl2·2H2O，0.02 g/L FeCl3·2H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O，在此條件下?lián)u瓶培養(yǎng)得到的甘露醇產(chǎn)量為61.7 g/L。以葡萄糖為底物要優(yōu)于以果糖為底物，甘露醇產(chǎn)量在葡萄糖濃度為200 g/L時(shí)達(dá)到最高，葡萄糖濃度過高反而抑制甘露醇的生成。進(jìn)行30 L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)，根據(jù)發(fā)酵曲線得知72 h時(shí)甘露醇最大產(chǎn)量為80.3 g/L。本研究獲得的菌株具有應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的潛能，其結(jié)果為高效、低成本工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)一步的發(fā)酵過程研究目前還在進(jìn)行中。

［1］Saha B C，Racine F M.Biotechnological production of mannitol and its applications［J］.Applied microbiology and biotechnology，2011，89(4):879－891.

［2］汪園.利用生物技術(shù)生產(chǎn)甘露醇的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，22(3):291－293.

［3］于冬梅，杜煜光.生物合成法生產(chǎn)D-甘露醇的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊，2008(1):36－39.

［4］周文英，范家恒.甘露醇工業(yè)化制造方法的評(píng)述［J］.甘蔗糖業(yè)，2005(5):46－50.

［5］蔣華.產(chǎn)甘露醇乳酸菌的研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2005:4－5.

［6］Racine F M，Saha B C.Production of mannitol by Lactobacillus intermedius NRRL B-3693 in fed-batch and continuous cell-recycle fermentations［J］.Process Biochemistry，2007，42:1 609－1 613.

［7］Song K H，Lee J K，Song J Y，et al.Production of mannitol by a novel strain of Candida magnoliae［J］.Biotechnology Letters，2002，24(1):9－12.

［8］Onishi H，Suzuki T.Production of D-mannitol and glycerol by yeasts［J］.Applied Microbiology，1968，16(12):1847－1852.

［9］林琳，岳敏，曹海龍，等.產(chǎn)甘露醇菌株的育種研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(11):426－430.

［10］Yun J W，Kim D H.A comparative study of mannitol production by two lactic acid bacteria［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1998，85(2):203－208.

［11］侯建革，王芳，王麗麗，等.布氏乳桿菌產(chǎn)生甘露醇的發(fā)酵研究［J］.河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31(2):132－136.

［12］Song S H，Vieille C.Recent advances in the biological production of mannitol［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84(1):55－62.

［13］巴尼特，胡瑞卿.酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)［M］.青島:青島海洋大學(xué)出版社，1991.

［14］袁野，王正祥.產(chǎn)多元醇酵母的耐高滲生長特征［J］.無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào):食品與生物技術(shù)，1999，18(3):42－46.

［15］王正祥，諸葛健.酵母細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)與甘油代謝［J］.生物工程進(jìn)展，1999，19(5):34－38.

［16］Lee J K，Oh D K，Song H Y，et al.Ca2+and Cu2+supplementation increases mannitol production by Candida magnoliae［J］.Biotechnology Letters，2007，29(2):291－294.

［17］Tang Y，Yue L，Peng C，et al.The affect of growth and phenol degrading on phenol degrading strain XH-10 with different metal ions［J］.Bioprocess，2012，2:31－39.

［18］寇明旭，劉全陽.金屬離子對(duì)活性污泥微生物影響研究進(jìn)展［J］.山西建筑，2007(5):176－177.

［19］Ghoreishi S M，Shahrestani R G.Innovative strategies for engineering mannitol production［J］.Trends in Food Science＆ Technology，2009，20(6):263－270.

［20］Gaspar P，Neves A R，Ramos A，et al.Engineering Lactococcus lactis for production of mannitol:high yields from food-grade strains deficient in lactate dehydrogenase and the mannitol transport system［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，70(3):1466－1474.