劉姝，房耀維，呂明生，焦豫良，閆晨，高家盼，高于卜，王淑軍

(淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院，江蘇連云港，222005)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)又名 4-氨基丁酸(4-aminobutyric acid，4-AB、γ-氨酪酸)，是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸［1］。GABA為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，因其具有降低血壓、促進(jìn)睡眠、增強(qiáng)記憶力、改善更年期綜合癥、延緩衰老、健肝利腎等諸多功效，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療及保健，需求量較大［2］。GABA可以化學(xué)合成，也可以生物合成。雖然化學(xué)合成效率高，但是成本高，安全性差［3］。動(dòng)物、植物以及微生物中都有GABA存在，但傳統(tǒng)的生物合成GABA主要是利用植物富集方法，效率較低［4］。微生物發(fā)酵產(chǎn)GABA快速，易于工業(yè)化生產(chǎn)并不受季節(jié)限制，受到研究者的廣泛關(guān)注。研究人員分別從發(fā)酵食品、植物葉面等篩選到產(chǎn)GABA的乳酸菌、霉菌及酵母。部分乳酸菌(Lactobacillus)，紅曲霉(Monascus)和酵母都在食品生產(chǎn)中獲得了長(zhǎng)期使用，具有較高的安全性，可用于GABA的合成［5－7］。

海洋微生物往往可以分泌低溫酶，低溫酶在低溫條件下可進(jìn)行高效催化，節(jié)省能源［8］。本研究室從海洋酵母中篩選獲得1株產(chǎn)GABA的海洋酵母OY92，經(jīng)生理生化及分子生物學(xué)鑒定為海洋紅酵母Rhodotorula benthica。該菌株在改良的 YM培養(yǎng)基中，20℃，160 r/min發(fā)酵3d，GABA合成量達(dá)到6.56 g/L(另文發(fā)表)。因此，本研究旨在通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化菌株OY92搖瓶發(fā)酵條件，為該菌株的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

海洋酵母菌株 Rhodotorula benthica OY92，本研究室保存。

1.2 試劑

蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物，英國(guó)Oxoid公司;GABA標(biāo)樣，美國(guó)Sigma公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

改良酵母麥芽汁培養(yǎng)基(YM):酵母提取物3 g，麥芽提取物 3 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，MgSO4·7H2O 1 g，NaCl 4 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0;

種子培養(yǎng)基:蛋白胨5 g，酵母提取物3 g，葡萄糖 10 g，NaCl 4 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.0。

1.4 儀器與設(shè)備

PHS-3C型精密酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器廠;L28500A氨基酸自動(dòng)分析儀，日本日立公司;Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.5 GABA測(cè)定

利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定GABA［9］。取5 mL發(fā)酵液，加入5 mL 10%的三氯乙酸(TDA)，振蕩均勻，10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm纖維素濾膜適度稀釋后上樣分析。

1.6 單因素試驗(yàn)

利用改良YM培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，起始條件設(shè)定為接種量 1%，20℃，160 r/min，發(fā)酵起始 pH6.0，發(fā)酵時(shí)間72 h。保持其他條件不變，分別考察接種量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵起始pH及發(fā)酵時(shí)間對(duì)GABA發(fā)酵水平的影響。

1.7 發(fā)酵優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用PB試驗(yàn)對(duì)酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨、葡萄糖、MgSO4·7H2O、NaCl、接種量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵起始pH等10個(gè)因素進(jìn)行考查和分析，篩選影響GABA發(fā)酵水平的主要限制因子。然后通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析確定最佳培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

PB試驗(yàn)采用JMP軟件(version 10.0.2，SAS Institute Inc.，Cary，NC)，響應(yīng)面試驗(yàn)采用設(shè)計(jì)專(zhuān)家軟件(Version 8.0，Stat-Ease Inc.，Minneapolis，USA)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析，模型及因素的顯著性均通過(guò)F檢驗(yàn)(P＜0.05)。所有試驗(yàn)除非特殊說(shuō)明均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

利用改良YM培養(yǎng)基研究接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵起始pH、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間對(duì)GABA發(fā)酵水平的影響。結(jié)果如圖1所示。接種量對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA的影響不顯著，當(dāng)接種量為2% ～7%時(shí)，發(fā)酵水平無(wú)顯著變化，從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，可以選擇接種量為2%。菌株在20～30℃產(chǎn)GABA水平較高，在22.5℃最高。多數(shù)酵母菌的最適生長(zhǎng)溫度為25～30℃，本研究菌株分離于海洋環(huán)境，所以菌株的發(fā)酵產(chǎn)GABA溫度較低，這也是本菌株產(chǎn)GABA的優(yōu)勢(shì)所在，在較低的溫度下發(fā)酵生產(chǎn)可以節(jié)省能源，降低生產(chǎn)成本。pH對(duì)菌株產(chǎn)GABA影響顯著，酸性條件利于菌株產(chǎn)GABA，在堿性條件下，GABA產(chǎn)量顯著下降?？赡苁怯捎诮湍妇嗌L(zhǎng)于偏酸性環(huán)境，酸性利于酵母的生長(zhǎng)［10］。轉(zhuǎn)速同發(fā)酵培養(yǎng)基的溶氧及剪切力相關(guān)，酵母菌屬于兼性好氧菌，溶氧量過(guò)高和偏低都不利于酵母菌生長(zhǎng)和代謝，另外，轉(zhuǎn)速增加，剪切力增加，剪切力過(guò)大會(huì)影響酵母菌株生長(zhǎng)。時(shí)間對(duì)菌株R.benthica OY92產(chǎn)GABA的影響如圖2，培養(yǎng)108h后GABA產(chǎn)量達(dá)到最大值7.39 g/L。

圖1 接種量(a)、發(fā)酵溫度(b)、發(fā)酵起始pH(c)、轉(zhuǎn)速(d)對(duì)菌株R.benthica OY92發(fā)酵產(chǎn)GABA的影響Fig.1 The effects of incubation size(a)，temperature(b)，initial pH(c)，and rotation speed(d)for the production of GABA of strain R.benthica OY92

2.2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選主要影響因子

圖2 時(shí)間對(duì)菌株R.benthica OY92發(fā)酵產(chǎn)GABA的影響Fig.2 The effects of incubation time for the production of GABA of strain R.benthica OY92

PB試驗(yàn)可以通過(guò)較少的試驗(yàn)次數(shù)從眾多相關(guān)因素中篩選出對(duì)目的響應(yīng)具有顯著影響的因素，從而廣泛應(yīng)用于篩選和評(píng)價(jià)影響發(fā)酵因素的顯著因子。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨、葡萄糖、MgSO4·7H2O、NaCl、接種量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵起始pH等進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各自變量及其代碼、編碼和水平見(jiàn)表1。以GABA發(fā)酵水平為響應(yīng)值，試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)GABA發(fā)酵水平進(jìn)行回歸分析，得到各影響因子的回歸系數(shù)及其顯著性(表3)。從分析結(jié)果中可以看出，常數(shù)項(xiàng)較顯著(P＜0.001)，表明PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得的模型高度顯著。對(duì)GABA發(fā)酵水平具有顯著影響的因素為Mg-SO4·7H2O、NaCl和起始 pH。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Level and code of variables chosen for Plackett-Burman experimental design

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental results of Plackett-Burman design

2.3 Box-Behnken中心組合優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果與響應(yīng)面分析

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)GABA發(fā)酵水平有顯著影響的3個(gè)因素即MgSO4·7H2O、NaCl和起始pH進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件，設(shè)定 MgSO4·7H2O、NaCl和起始 pH分別為X1、X2、X3，設(shè)計(jì) N=17 的 3 因素 3 水平的 Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。利用Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，確定多項(xiàng)式回歸模型如式(1)。對(duì)此多項(xiàng)式回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。模型和失擬項(xiàng)的P值分別為 ＜0.000 1和0.31，即模型高度顯著，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型選擇較準(zhǔn)確。R2為0.999 7，表明模型的相關(guān)性很好，Adj R2=0.999 3表明只有0.03%的變化不能用模型解釋?zhuān)Ｐ团c實(shí)際情況擬合的很好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，分析結(jié)果可信，因此可以用此回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variables and test levels for Plackett-Burman experiment

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Level and code of variables chosen for Box-Behnken design

表5 回歸方程的方差分析Table 5 ANOVA analysis for regression equation

利用Design-Expert軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各響應(yīng)面的二維等高線和三維立體圖(圖3～圖5)。利用二維等高線和三維立體圖可以分析和評(píng)估任何2個(gè)因素的交互作用對(duì)海洋酵母菌R.benthica OY92產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響效應(yīng)，從中確定最佳因素水平。每組圖顯示在設(shè)定其中一個(gè)因素影響效應(yīng)為零的情況下，另外兩個(gè)因素對(duì)GABA發(fā)酵因素的影響。從3組圖中可以看出任意兩組因素之間都有顯著的交互作用。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design-Expert軟件的Optimization模塊，對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果及二次多項(xiàng)回歸方程進(jìn)一步分析，預(yù)測(cè)獲得在MgSO4·7H2O 1.21 g/L，NaCl 4.79 g/L，起始pH5.75時(shí)發(fā)酵產(chǎn)GABA水平最高達(dá)到13.89 g/L。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在預(yù)測(cè)的最佳產(chǎn)GABA條件下進(jìn)行3次平行發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)的產(chǎn)GABA水平分別為13.93，13.68和13.92 g/L，表明所得模型能較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)發(fā)酵產(chǎn)GABA的實(shí)際水平。

圖3 NaCl與MgSO4·7H2O對(duì)R.benthica OY92產(chǎn)GABA影響的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.3 Surface and contour plots for the effect of NaCl and MgSO4·7H2O on the production of GABA of R.benthica OY92

圖4 起始pH與MgSO4·7H2O對(duì)R.benthica OY92產(chǎn)GABA影響的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.4 Surface and contour plots for the effect of initial pH and MgSO4·7H2O on the production of GABA of R.benthica OY92

圖5 起始pH與NaCl對(duì)R.benthica OY92產(chǎn)GABA影響的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.5 Surface and contour plots for the effect of initial pH and NaCl on the production of GABA of R.benthica OY92

產(chǎn)GABA的菌株多為安全性良好的乳酸菌為主，不同的菌株產(chǎn)GABA的水平差異較大。目前篩選報(bào)道的利用搖瓶發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)GABA的發(fā)酵水平從小于1 g/L到接近35 g/L均有報(bào)道［10－15］。其中較高的菌株有馮宇等從酸菜中篩選的短乳桿菌經(jīng)誘變選育后，發(fā)酵3 d產(chǎn)量達(dá)到24g/L，發(fā)酵優(yōu)化以后達(dá)到27.12 g/L［16］;日本學(xué)者掘江典子篩選的乳酸菌株GABA產(chǎn)量達(dá)35 g/L;劉婷婷篩選的植物乳桿菌培養(yǎng)后轉(zhuǎn)化谷氨酸，轉(zhuǎn)化液GABA產(chǎn)量達(dá)34.26 g/L;黃俊等獲得的乳酸菌經(jīng)誘變和發(fā)酵優(yōu)化后搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為33.42 g/L，3.7 L發(fā)酵罐中GABA發(fā)酵水平達(dá)到76.36 g/L［4］。本研究篩選獲得的海洋酵母菌 R.benthica OY92優(yōu)化后搖瓶發(fā)酵水達(dá)到13.89 g/L。雖然發(fā)酵水平還不高，但是該海洋酵母菌發(fā)酵產(chǎn)GABA發(fā)酵溫度較低，節(jié)省能源，另外，菌株OY92發(fā)酵產(chǎn)GABA時(shí)生物量較高，濕重達(dá)到500 g/L。海洋紅酵母具有豐富的氨基酸、礦物質(zhì)，可以進(jìn)一步進(jìn)行開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

3 結(jié)論

本研究對(duì)海洋酵母菌產(chǎn)GABA的影響因素進(jìn)行了優(yōu)化研究。在通過(guò)單因素試驗(yàn)考查接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵起始pH、轉(zhuǎn)速對(duì)GABA發(fā)酵水平的影響的基礎(chǔ)上，利用PB試驗(yàn)篩選出對(duì)菌株產(chǎn)GABA發(fā)酵水平有顯著影響的因素為 MgSO4·7H2O、NaCl和起始pH。利用Design Expert軟件采用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì) MgSO4·7H2O、NaCl和起始pH進(jìn)行優(yōu)化研究，準(zhǔn)確建立與驗(yàn)證菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA的二次多項(xiàng)回歸方程，得到優(yōu)化產(chǎn)GABA的最佳條件為Mg-SO4·7H2O 1.21 g/L，NaCl 4.79 g/L，起始 pH 5.75，在此條件下，GABA發(fā)酵水平達(dá)到13.89 g/L，為菌株的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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